葛根素诱导破骨细胞自噬的机制研究(2)
1.4 蛋白质印迹法(Western-blot)检测相关蛋白的表达
采用Western-Blot检测不同浓度Pur组和对照组LC3Ⅱ/Ⅰ、p62、Akt、p-Akt和p-s6的蛋白表达。提取各组细胞总蛋白，先用BCA(2，2-联喹啉-4，4-二甲酸二钠)法进行蛋白定量测定。加入上样缓冲液，在95℃下变性10 min。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h后，分别加入LC3、p62、Akt、p-Akt和p-s6单克隆抗体，在4℃环境下过夜，接着用TBST缓冲液洗膜3次，10 min/次，加入二抗，在室温下孵育2 h，再次用TBST缓冲液洗膜。将得到的膜与电化学发光(ECL)试剂充分反应后，曝光于X线胶片上，显影、定影、扫描后进行图像分析。应用Image-Pro Plus 6.0软件对各个特异性条带进行累计吸光度检测，最后以积分吸光度值(IOD)来表示。
1.5 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，采用One-Way ANOVA检验 ......
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采用Western-Blot检测不同浓度Pur组和对照组LC3Ⅱ/Ⅰ、p62、Akt、p-Akt和p-s6的蛋白表达。提取各组细胞总蛋白，先用BCA(2，2-联喹啉-4，4-二甲酸二钠)法进行蛋白定量测定。加入上样缓冲液，在95℃下变性10 min。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h后，分别加入LC3、p62、Akt、p-Akt和p-s6单克隆抗体，在4℃环境下过夜，接着用TBST缓冲液洗膜3次，10 min/次，加入二抗，在室温下孵育2 h，再次用TBST缓冲液洗膜。将得到的膜与电化学发光(ECL)试剂充分反应后，曝光于X线胶片上，显影、定影、扫描后进行图像分析。应用Image-Pro Plus 6.0软件对各个特异性条带进行累计吸光度检测，最后以积分吸光度值(IOD)来表示。
1.5 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，采用One-Way ANOVA检验 ......
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