延髓头端腹外侧部在脑梗死合并心律失常中的作用(1)
[摘要] 目的 探讨延髓头端腹外侧部在脑梗死合并心律失常中的作用及可能机制。 方法 112只Wistar大鼠随机分为3组：对照组(n=16)、假手术组(n=16)和模型组(n=80)。模型组再随机分为造模后30 min、1 h、2 h、4 h 和8 h组，每组16只，观察脑梗死后延髓头端腹外侧部神经元活动的变化。另40只大鼠随机分为5组：对照组(n=8)、生理盐水组(10 μL，n=8)、L-谷氨酸组(0.5 μmol，10 μL，n=8)、谷氨酸非选择性NMDA受体拮抗剂MK-801(4 nmol，10 μL)加L-谷氨酸组(n=8)和MK-801加模型组(n=8)，以观察谷氨酸在脑梗死诱发心律失常中的作用。心电图用生物信号采集系统采集。脑梗死动物模型制作采用大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)，给药途径为侧脑室注射，以Fos蛋白作为神经元激活的标志物。 结果 对照组和假手术组大鼠心电图均无明显异常，模型组大鼠心律失常的发生率为78.75%(63/80)，明显高于对照组(P < 0.01)，且在心律失常发生的相应时间点延髓头端腹外侧部Fos蛋白表达明显增加(P < 0.01)。侧脑室注射生理盐水组心电图无明显异常，侧脑室注射L-谷氨酸后心律失常发生率为87.5%(7/8)，明显高于生理盐水组(P < 0.01)，心律失常类型类似于模型组，同时延髓头端腹外侧部Fos蛋白表达明显增高(P < 0.05)。MK-801预处理后再造模和MK-801预处理后再侧脑室注射L-谷氨酸组，均无心律失常发生，延髓头端腹外侧部Fos蛋白表达无显著性变化(P > 0.05)。 结论 脑梗死合并心律失常的发生与延髓头端腹外侧部活动增强有关，且此作用由谷氨酸激活NMDA受体介导。
[关键词] 延髓头端腹外侧部；脑梗死；心律失常；谷氨酸；NMDA受体
[中图分类号] R338 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721(2016)11(a)-0011-05
脑梗死合并心律失常是脑梗死猝死的主要原因之一[1]。大量研究表明，脑自主神经功能失衡，特别是交感神经过度激活可致心律失常的发生[2]。合并心律失常的脑梗死患者存在着交感和副交感神经活动失衡[3-4]，但特异性的心电图異常与局部颅内病变之间的对应关系尚未建立。延髓头端腹外侧部(rostral ventrolateral medulla，RVLM)是脑内控制自主神经功能和心血管活动的关键脑区，本研究观察了RVLM活动变化在脑梗死合并心律失常中的作用及可能机制，以期为临床治疗提供理论依据，并丰富心血管功能活动调节的中枢机制。
1 资料与方法
1.1 实验动物
健康雄性Wistar大鼠，体重(230±20)g，由哈尔滨医科大学实验动物学部提供，实验动物生产许可证号：SCXK(黑)2013-001，实验动物使用许可证号：SYXK(黑)2013-002。
1.2 药物与试剂
c-Fos多克隆抗体(sc-52，Santa Cruz)、AP标记的山羊抗兔二抗(zb-2308)和AP标记的马抗小鼠二抗(zd-2310)均购自中杉金桥公司。GAPDH单克隆抗体(小鼠)购自碧云天生物技术研究所。TTC购自中国医药上海化学试剂公司。
1.3 仪器
大鼠脑立体定位仪SN-3，日本Narishige；显微图像采集系统，日本Olympus；石蜡切片机RM2016，德国徕卡；凝胶成像系统，美国Alpha；RM6240B生物信号采集系统，中国成都泰盟。
1.4 实验分组
所有大鼠监测心电20 min，心电图正常者用于实验。为了观察脑梗死后RVLM神经元活动的变化，112只大鼠随机分为3组：对照组(n=16)、假手术组(n=16)和模型组(n=80)。模型组再随机分为造模后30 min、1 h、2 h、4 h和8 h组，每组16只。对照组和假手术组大鼠在麻醉后或假手术操作后2 h取材，模型组大鼠在造模后相应的时间点取材。用免疫组织化学技术和Western blot技术检测每只大鼠右侧脑(缺血侧)RVLM脑区Fos蛋白的表达。为了观察谷氨酸在脑梗死诱发心律失常中的作用，40只大鼠随机分为5组，每组8只：对照组、生理盐水组(10 μL)、L-谷氨酸组(0.5 μmol，10 μL)、MK-801(4 nmol，10 μL)后20 min再L-谷氨酸组和MK-801(4 nmol，10 μL)后20 min再造模组。所有大鼠在侧脑室注射后或术后30 min取材。用Western blot技术检测每只大鼠右侧脑RVLM脑区Fos蛋白表达。
1.5 脑缺血动物模型制备
水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉。栓线经颈总动脉、颈内动脉插入大脑中动脉，进线长度距颈总动脉分叉(17.5 ± 0.5)mm[5]。假手术组栓线到大脑中动脉起始处后立即撤回，其余操作与模型组相同。
1.6 模型鉴定
神经功能学评分大于2分且TTC染色梗死区明显者计入模型组。
1.6.1 神经功能学评分 神经功能学评分值为0～4分，其中，没有神经功能缺陷计0分；前肢屈曲计1分；对侧前肢轻度抓爪计2分；让大鼠自由活动，拉其尾巴后大鼠向轻瘫侧绕圈行走计3分；如果大鼠未受任何刺激自发向轻瘫侧绕圈行走计4分[6-8]。
1.6.2 TTC染色 将大鼠脑做2 mm厚的连续冠状切片，置于2%的2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)生理盐水溶液中，37℃孵育15 min。红色染色区为正常脑组织，白色未染色区为梗死区。
1.7 免疫组化检测
大鼠灌注固定后将含RVLM的脑组织块石蜡包埋，冠状切片(5 μm)，水化，修复抗原，10% H2O2灭活内源性过氧化物后5% BSA封闭，兔来源的Fos抗体(1∶200)4℃孵育过夜，PBS洗3次，二抗(1∶500)37℃孵育30 min，DAB避光染色5 min，水冲，苏木精染色30 s，水冲，再次脱水、透明，中性树胶封片，显微镜下观察计数。Fos表达阳性神经元的核呈黄棕色染色，在高倍镜(400×)下分别计数5个区域阳性神经元数，然后取平均值。, 百拇医药(贾淑伟 王玲 焦润生)
[关键词] 延髓头端腹外侧部；脑梗死；心律失常；谷氨酸；NMDA受体
[中图分类号] R338 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721(2016)11(a)-0011-05
脑梗死合并心律失常是脑梗死猝死的主要原因之一[1]。大量研究表明，脑自主神经功能失衡，特别是交感神经过度激活可致心律失常的发生[2]。合并心律失常的脑梗死患者存在着交感和副交感神经活动失衡[3-4]，但特异性的心电图異常与局部颅内病变之间的对应关系尚未建立。延髓头端腹外侧部(rostral ventrolateral medulla，RVLM)是脑内控制自主神经功能和心血管活动的关键脑区，本研究观察了RVLM活动变化在脑梗死合并心律失常中的作用及可能机制，以期为临床治疗提供理论依据，并丰富心血管功能活动调节的中枢机制。
1 资料与方法
1.1 实验动物
健康雄性Wistar大鼠，体重(230±20)g，由哈尔滨医科大学实验动物学部提供，实验动物生产许可证号：SCXK(黑)2013-001，实验动物使用许可证号：SYXK(黑)2013-002。
1.2 药物与试剂
c-Fos多克隆抗体(sc-52，Santa Cruz)、AP标记的山羊抗兔二抗(zb-2308)和AP标记的马抗小鼠二抗(zd-2310)均购自中杉金桥公司。GAPDH单克隆抗体(小鼠)购自碧云天生物技术研究所。TTC购自中国医药上海化学试剂公司。
1.3 仪器
大鼠脑立体定位仪SN-3，日本Narishige；显微图像采集系统，日本Olympus；石蜡切片机RM2016，德国徕卡；凝胶成像系统，美国Alpha；RM6240B生物信号采集系统，中国成都泰盟。
1.4 实验分组
所有大鼠监测心电20 min，心电图正常者用于实验。为了观察脑梗死后RVLM神经元活动的变化，112只大鼠随机分为3组：对照组(n=16)、假手术组(n=16)和模型组(n=80)。模型组再随机分为造模后30 min、1 h、2 h、4 h和8 h组，每组16只。对照组和假手术组大鼠在麻醉后或假手术操作后2 h取材，模型组大鼠在造模后相应的时间点取材。用免疫组织化学技术和Western blot技术检测每只大鼠右侧脑(缺血侧)RVLM脑区Fos蛋白的表达。为了观察谷氨酸在脑梗死诱发心律失常中的作用，40只大鼠随机分为5组，每组8只：对照组、生理盐水组(10 μL)、L-谷氨酸组(0.5 μmol，10 μL)、MK-801(4 nmol，10 μL)后20 min再L-谷氨酸组和MK-801(4 nmol，10 μL)后20 min再造模组。所有大鼠在侧脑室注射后或术后30 min取材。用Western blot技术检测每只大鼠右侧脑RVLM脑区Fos蛋白表达。
1.5 脑缺血动物模型制备
水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉。栓线经颈总动脉、颈内动脉插入大脑中动脉，进线长度距颈总动脉分叉(17.5 ± 0.5)mm[5]。假手术组栓线到大脑中动脉起始处后立即撤回，其余操作与模型组相同。
1.6 模型鉴定
神经功能学评分大于2分且TTC染色梗死区明显者计入模型组。
1.6.1 神经功能学评分 神经功能学评分值为0～4分，其中，没有神经功能缺陷计0分；前肢屈曲计1分；对侧前肢轻度抓爪计2分；让大鼠自由活动，拉其尾巴后大鼠向轻瘫侧绕圈行走计3分；如果大鼠未受任何刺激自发向轻瘫侧绕圈行走计4分[6-8]。
1.6.2 TTC染色 将大鼠脑做2 mm厚的连续冠状切片，置于2%的2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)生理盐水溶液中，37℃孵育15 min。红色染色区为正常脑组织，白色未染色区为梗死区。
1.7 免疫组化检测
大鼠灌注固定后将含RVLM的脑组织块石蜡包埋，冠状切片(5 μm)，水化，修复抗原，10% H2O2灭活内源性过氧化物后5% BSA封闭，兔来源的Fos抗体(1∶200)4℃孵育过夜，PBS洗3次，二抗(1∶500)37℃孵育30 min，DAB避光染色5 min，水冲，苏木精染色30 s，水冲，再次脱水、透明，中性树胶封片，显微镜下观察计数。Fos表达阳性神经元的核呈黄棕色染色，在高倍镜(400×)下分别计数5个区域阳性神经元数，然后取平均值。, 百拇医药(贾淑伟 王玲 焦润生)