RGD高分子材料用于周围神经修复的生物学评价
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摘 要：采用自行设计研制的新型可降解仿生RGD高分子材料用于周围神经缺损的修复治疗，研究其促进神经修复的作用。为了了解复合材料的特性，本试验从体外和体内试验多方面进行了评价。研究结果显示，RGD高分子材料导管具有良好的生物相容性，是一种理想的周围神经修复材料。
关键词：RGD高分子材料；周围神经；修复；生物学评价
中图分类号：R745 文献标识码：A 文章编号：1673-2197(2008)04-015-04
新型生物材料近年来迅猛发展，材料的组成、形态、植入部位及用途日趋复杂，随着组织工程研究的日益深入，人工合成的高分子材料及各种具有神经营养作用的生长因子复合材料进行神经缺损的修复越来越受到重视[1-4]，随之对材料的评价相应也提出了更高的要求。对生物材料进行有效性和安全性评价是生物材料进入临床前的关键环节[5]。本实验从体内和体外实验对自行设计的仿生材料RGD高分子材料进行了生物学评价。
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1 材料与方法
1.1 复合材料的制备
以神经基底膜结构与组成的分析研究为基础，设计并制备了RGD高分子复合材料〔RGD多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)/PDLLA/β-TCP〕，尺寸为 12mm×6mm×0.3 mm的薄膜，动物实验前将膜缝制成直径为1.5mm长12mm的导管。
1.2 体内评价实验
选择体重约250g 的SPF级Wistar (由武汉疾病控制中心实验动物所提供)，分离单侧坐骨神经，切断，造成10 mm缺损，将RGD导管对动物模型离段神经进行桥接。分别于3个月、6个月取材，进行组织学观察。三头肌湿重比，电生理测定，电镜及光镜下的观察。
1.3 体外评价实验
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(1)材料的体外降解实验：将材料置于模拟体液中，测定其介质PH值的变化和测定材料质量损耗率。(2)细胞活力的测定：将分离纯化的外周神经胶质细胞即雪旺细胞置于材料培养基中进行体外培养，然后采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法进行细胞活力的测定。可以反映活细胞数量和细胞代谢活性，从而间接反映生物材料的细胞毒性。(3)形态学观察：在相差倒置显微镜下观察细胞在生物材料表面或在其浸提液中的生长状况，进行细胞粘附、增殖和分化，细胞数目，细胞突起长度等多种指标。将RSC96细胞制成密度为106大小的细胞悬液，接种到24孔板中的复合膜上，每孔1ml，置于培养箱中，隔天换液，培养5天后取出，用戊二醛固定后，扫描电镜观察材料上细胞的生长情况。
2 结果
2.1 体内评价结果
2.1.1 电生理检测
术后所有大鼠术侧即右侧小腿三头肌萎缩，6个月较3个月有所恢复 (见表1)。血管的再生和重建，反映了生物材料与宿主组织间良好的相容性。检测右侧坐骨神经传导速度(见表2)，结果显示，再生神经已经生长通过缺损段，运动神经传导速度(motor nerve conduction velocity，MNVC)反应了神经干的传导功能，再生轴突髓鞘化和成熟程度的指标。6个月时RGD高分子材料神经传导速度达64.24±0.79m/s，与自体神经移植接近(P>0.05)。
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2.1.2 亚甲蓝多色液染色
3个月后，再生神经亚甲蓝染色图片显示神经纤维密度大，有髓神经多，髓鞘大，多呈圆形图。移植6个月神经纤维直径较3个月显著增大，髓鞘厚度也有所增加，神经纤维密度大，但较自体神经组密度稍小，轴突直径和厚度与自体神经移植相当。
2.1.3 HE染色
HE染色片光镜下观察，3个月后RGD高分子材料组再生神经外膜完整，再生神经截面呈椭圆形，可清晰分辨出神经外膜，神经束膜和材料区，神经纤维数目多，大小均匀，成熟良好，在材料区可见RGD复合材料已成碎片状，内有细胞长入，材料外层有纤维组织包裹。6个月后，材料降解较3个月时多，碎片有所减少，材料区内有细胞长入，外层有纤维组织包裹。
2.1.4 透射电镜观察结果
移植3个月后，雪旺细胞较多，雪旺细胞功能活跃，细胞器丰富，胞质内含有丰富的内质网，神经丝和微管，游离核蛋白体发达，细胞外层基板连续，结构完好，轴突内线粒体多，结构完好，轴突内神经丝略松散；髓鞘板层结构致密。6个月后，再生神经纤维数目较多，与自体神经移植数目相当。与3个月相比，再生神经纤维的轴突面积明显增大。
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2.1.5 免疫组化染色分析
S-100免疫组化染色片显示移植3个月后，S-100阴性片子由于无S-100蛋白表达，背底呈淡蓝色，无阳性反应，6个月后阳性部位较少。
2.1.6 材料的扫描电镜观察
体内植入3个月后，复合膜中RGD高分子材料部分降解，形成孔隙，6个月后，孔隙进一步变大并连通(图1、2)
图1 3个月 电镜扫描
图2 6个月 电镜扫描
2.2 体外评价结果
2.2.1 膜质量损耗率的变化及介质PH值的变化
RGD高分子材料降解速度较快，在第4周时膜损耗率超过30%，第12周时超过50%，第24周时膜损耗率已达到70%。pH值下降较快，24周内的降解pH值基本呈下降趋势，第2周左右达6.8，呈微酸性(图3)。
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图3 RGD复合材料体外降解3个月分子量的变化
2.2.2 细胞活力的测定
雪旺细胞在RGD高分子材料上能够较好地增殖，与空白对照组相差不大，尤其是在培养7天以后，其增殖能力良好。
2.2.3 形态学观察
在相差倒置显微镜下观察RSC96细胞在RGD高分子材料上的生长图片，细胞生长状况良好，密度较大，RGD为多孔材料，孔隙直径在3.8um~7.6um之间，部分细胞向膜的孔隙中生长，细胞突起于膜片表面及孔隙中交织；细胞平铺于材料表面生长，由于RGD高分子材料降解速率快，膜表面孔径较大，直径在1.5~30um之间，部分细胞向膜孔隙中生长( 图4，5)。
图4 扫描电镜观察RSC96细胞 RGD×2000
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图5 在材料上的生长情况 RGD×3000
3 讨论
神经修复材料的基本要素：理想的神经修复用支架材料应具备以下几个特点：①良好的生物相容性，无毒性反应；②可降解性，避免二次手术取出；材料降解速率与组织再生完成的时间匹配；③通透性，材料应具有微孔或网眼结构以保证一定的通透性，使氧气、小分子营养物质等可进入到再生神经短段微环境中；④合适的可塑性和力学性能；能在一定时限内保持其外形和结构的完整性[6]。目前，用于神经修复的支架材料主要是一些可降解的天然基质材料和人工合成材料。生物活性分子RGD 肽(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸) 作为天然ECM 重要组成，是目前应用最广、最有效的促黏附肽[7]。
RGD高分子材料的制备及原理：运用仿生学原理模拟细胞外基质蛋白与其周围细胞的相互作用，用物理或化学的方法在材料上接上粘附性蛋白或多肽以赋予材料生物信号，促进细胞粘附到材料上。本实验将L-赖氨酸与α-羟基酸(羟基乙酸，乳酸)共聚制备聚(乳酸-羟基乙酸-L-赖氨酸)，然后通过L-赖氨酸的侧氨基引入短肽RGD高分子材料，得到RGD高分子材料多肽接枝聚(乳酸-羟基乙酸-L-赖氨酸)，再将RGD高分子材料多肽接枝聚与PLA复合，所得的RGD高分子材料高分子复合材料兼具天然基质材料和人工合成材料两者的优点。乳酸和羟基乙酸的共聚物(PLGA)，属于α- 羟基酸衍生的脂肪族聚脂，降解性能和力学性能较好；具有很好的生物相融性，在生物体内的最终降解产物为水和CO2无毒的生物小分子而被人体直接吸收[8]，被美国FDA 认证为可应用于人体的可降解材料、药物释放控制体系和其它人体植入的装置[7，9]。天然基质材料精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸 ((Arg-Gly- Asp，RGD)，因其含有特定的氨基酸序列而具有细胞识别信号，有利于细胞粘附；另一方面，PLA的降解产物显酸性，易导致局部炎症反应，而β-磷酸三钙(β-TCP)在体内水解呈弱碱性，与人体骨骼组织的无机成份相似，具有良好的生物相容性，易被生物降解吸收，无毒副作用，加入β-TCP可缓解PLA降解造成的局部酸性环境。, 百拇医药(王永红 殷义霞 严琼娇 李世普)