弓形虫基因缺陷虫株建立方法的初步研究
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谭逵 张琼 范久波 谢荣华 蒋立平 官剑武 舒衡平 吴翔 中南大学湘雅医学院寄生虫学教研室 中南大学湘雅医学院寄生虫学教研室 中南大学湘雅医学院寄生虫学教研室 中南大学湘雅医学院寄生虫学教研室 中南大学湘雅医学院寄生虫学教研室 中南大学湘雅医学院寄生虫学教研室 中南大学湘雅医学院寄生虫学教研室 中南大学湘雅医学院寄生虫学教研室
【摘要】目的:应用电穿孔技术转染Tg P24基因敲除转染质粒于弓形虫RH,探讨电穿孔技术的应用条件,以及Tg P24基因敲除质粒转染虫株在不同哺乳动物细胞中筛选的最适条件。方法:设定所需的电穿孔参数、条件,如电压,电容,脉冲次数,电击杯的大小,电转染缓冲液,电穿孔后,将弓形虫悬浮液分别转移到长有不同贴壁细胞的培养瓶中,37℃,5%CO_2(体积分数)的培养箱中培养,观察弓形虫的生长状况,并对不同电穿孔参数、条件下的弓形虫存活率进行比较。12hr后换成加有福来霉素的完全培养基中选择培养,不同时间观察虫体及细胞生长情况;在细胞中选择培养10天后,收集虫体,4℃下福来霉素处理7天,再回复到细胞内用选择培养基培养5天,收集虫体,腹腔注射昆明小鼠,大量收集弓形虫用于提取RNA进行RT-PCR。结果:优化电穿孔条件后的弓形虫存活率得到提高(P0.05);在选择浓度为5.0μg/ml-7.5μg/ml的福来霉素培养基中,筛选虫株采用L929细胞做为宿主细胞最为适合;RT-PCR结果显示L929细胞筛选基因敲除虫株的效果较好。结论:初步确定了弓形虫电穿孔技术的应用条件,以及TgP24基因敲除质粒转染虫株在不同哺乳动物细胞中的最佳筛选条件;获得了较好的转染效率,为进一步研究弓形虫TgP24基因敲除株的生物学特性打下了良好的基础。
【关键词】 弓形虫 电穿孔 基因敲除 哺乳动物细胞
【基金】国家自然科学基金(No.30371260) 湖南省“十.五”重大专项(NO.2006SK1001) 湖南省”十一.五”重点学科建设经费联合资助
【分类号】R346
现代生物医学进展.切w.btomed.net.en Pro少es.In Modern Bloxue山e纽e 20()8 Vol.8 N0.6·1017·弓形虫是一种专性细胞内寄生的机会致病原虫，生活史复杂，涉及的组织器官多，可引起人兽共患的弓形虫病。目前，弓形虫的防治尚无理想的药物，因此，研制廉价、安全、有效的弓
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摘要目的: 应用电穿孔技术转染Tg P24 基因敲除转染质粒于弓形虫RH，探讨电穿孔技术的应用条件，以及Tg P24 基因敲除质粒转染虫株在不同哺乳动物细胞中筛选的最适条件。方法: 设定所需的电穿孔参数、条件，如电压，电容，脉冲次数，电击杯的大小，电转染缓冲液，电穿孔后，将弓形虫悬浮液分别转移到长有不同贴壁细胞的培养瓶中，37℃，5%CO2(体积分数)的培养箱中培养，观察弓形虫的生长状况，并对不同电穿孔参数、条件下的弓形虫存活率进行比较。12hr后换成加有福来霉素的完全培养基中选择培养，不同时间观察虫体及细胞生长情况；在细胞中选择培养10 天后，收集虫体，4℃下福来霉素处理7 天，再回复到细胞内用选择培养基培养5 天，收集虫体，腹腔注射昆明小鼠，大量收集弓形虫用于提取RNA进行RT-PCR。结果: 优化电穿孔条件后的弓形虫存活率得到提高(P<0.05);在选择浓度为5.0滋g/ml-7.5滋g/ml 的福来霉素培养基中，筛选虫株采用L929 细胞做为宿主细胞最为适合；RT-PCR 结果显示L929 细胞筛选基因敲除虫株的效果较好。结论: 初步确定了弓形虫电穿孔技术的应用条件，以及Tg P24 基因敲除质粒转染虫株在不同哺乳动物细胞中的最佳筛选条件；获得了较好的转染效率，为进一步研究弓形虫Tg P24 基因敲除株的生物学特性打下了良好的基础。
关键词：弓形虫；电穿孔；基因敲除；哺乳动物细胞
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