AKT2基因短发夹结构RNA慢病毒载体的构建及鉴定
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崔勇 陈静 王君玉 王麒 胡国汉 骆纯 卢亦成 第二军医大学附属长征医院神经外科上海市神经外科研究所;
【摘要】目的:构建丝/苏氨酸蛋白激酶2(AKT2)基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体。方法:利用公用网站按照RNAi序列设计原则,设计RNAi靶点序列并合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经MluI和ClaI进行酶切后的PLVTHM载体连接产生shRNA慢病毒载体。应用shRNA慢病毒载体转染293T细胞及U87细胞,测定病毒滴度,流式细胞仪测定U87细胞的转染效率,PCR及Western blot鉴定AKT2基因在U87细胞中的下调作用。结果:成功构建了shRNA-AKT2慢病毒载体,经测序与设计合成的靶向链完全一致。荧光显微镜下观察293T细胞感染效率大于90%,病毒滴度为3.59×107TU/ml;流式细胞仪测定对AKT2细胞的转染效率为86.93%。PCR测定shRNA载体感染U87细胞后AKT2的干扰效率为68%。Western Blot结果显示该慢病毒载体对AKT2的表达有较为显著的敲减作用。结论:成功构建了人胶质瘤细胞株AKT2基因RNAi慢病毒载体,为后续的体内外功能学试验创造了条件。
【关键词】 丝/苏氨酸蛋白激酶 RNA干扰 短发夹结构RNA 慢病毒载体
【基金】国家自然科学基金(30930094)
【分类号】Q75
前言慢病毒载体作为新一代高效表达载体推进了肿瘤的基因治疗研究。siRNA介导的基因干扰技术是近几年发展起来的一个崭新的研究领域,因其简便易行并且具有特异性和高效性,已经成为研究基因功能和基因表达调控的重要方法[1,2]。慢病毒感染靶细胞发挥基因沉默的作用稳定而持久,
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前言
慢病毒载体作为新一代高效表达载体推进了肿瘤的基因治疗研究。siRNA介导的基因干扰技术是近几年发展起来的一个崭新的研究领域，因其简便易行并且具有特异性和高效性，已经成为研究基因功能和基因表达调控的重要方法。慢病毒感染靶细胞发挥基因沉默的作用稳定而持久，可显著提高RNA干扰(RNAi)的抑制效率。慢病毒载体能稳定介导基因沉默或过表达，具有很高的转染效率和较长时间的持续效应。
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