李辉，陈思，马娇颖，戴君，谢光蓉，陈建华

    ·论著·

    重组枯草芽孢杆菌猪尿酸氧化酶基因工程菌的构建和分泌表达

    李辉，陈思，马娇颖，戴君，谢光蓉，陈建华

    目的构建重组枯草芽孢杆菌猪尿酸氧化酶基因工程菌及其目的蛋白的分泌表达，并对其酶活性进行测定。

    芽孢杆菌，枯草； 尿酸氧化酶； 高尿酸血症； 分泌表达

    www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术, 2012, 7(3):187-190

    尿酸氧化酶又称尿酸酶(urate oxidase； uricase，EC 1.7.3.3，UOX)，是生物体内嘌呤降解代谢途径中的关键酶，它以分子氧为受体催化尿酸分解生成溶解度高的尿囊素、CO2和 H2O2[1-2]。许多物种体内均发现有尿酸氧化酶，但在鸟类及一些高等灵长类动物(如猿和人类)的体内却缺乏具有功能的尿酸酶，而是以尿酸作为嘌呤代谢的终产物[3-4]。尿酸及其盐类在水中溶解度很低，血液中积累过多会导致高尿酸血症，尿酸在患者体内软组织、关节、器官等处形成结晶而沉积，从而导致痛风等临床症状。

    目前使用的降低体内尿酸水平的药物主要分为三类：促进尿酸排泄药、抑制尿酸合成药和尿酸氧化酶[5]。有研究表明，尿酸氧化酶降低体内尿酸水平的幅度和速度远远优于其他药物[6]。随着基因工程技术的发展，工程菌表达尿酸酶能显著提高酶的产量，现在已有多种生物来源的重组尿酸酶得到表达[5, 7]。2010 年 9月，美国 FDA 批准了一种PEG 修饰的猪尿酸酶—— Krystexxa(pegloticase)的上市[8]。但是目前猪尿酸酶主要在大肠杆菌中表达，易于形成包涵体，且在提取时需要破壁、变性、复性等操作，降低了收率，增加了成本，使其工业化潜力及其他更为广泛的研究应用受到了一定的限制。因此，本实验通过将猪尿酸氧化酶基因与nprB 信号肽基因相连，导入穿梭载体 pP43X，在P43 启动子的调控下，首次实现了重组枯草芽孢杆菌猪尿酸氧化酶基因工程菌的高效分泌表达[9]。枯草芽孢杆菌是目前公认较为安全的宿主菌之一，且具有良好的合成分泌蛋白的能力。因此，重组枯草芽孢杆菌猪尿酸氧化酶基因工程菌的构建不仅简化了猪尿酸酶的分离提取步骤，同时具有潜在的市场前景和社会效益。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1菌株和质粒 大肠杆菌 DH5α，枯草芽孢杆菌 WB800，重组质粒 pET-22b/pUOX，穿梭载体 pP43X、pP43NMK 均为本实验室保存。

    1.1.2试剂 引物由上海英潍捷基生物有限公司合成 ......