殷瑜，戈梅，钱秀萍，陈代杰

    基于反义RNA技术的FabI抑制剂筛选模型的构建

    殷瑜，戈梅，钱秀萍，陈代杰

    目的基于反义 RNA 沉默技术构建针对细菌 FabI 的超敏全细胞筛选模型，用于筛选 FabI 抑制剂。

    方法以Escherichia coli基因组 DNA 为模板，PCR 扩增fabI基因的 -74 ～ 86 bp 核苷酸序列，反向插入携带 paired termini 结构的反义质粒 pHN678 中，得到重组质粒pHNF，再转化至E.coli中，得到反义工程菌E.coli/pHNF；通过平板表型观察对反义工程菌进行筛选；考察了 IPTG浓度对筛选模型的影响，确定 96 孔板抗菌筛选模型的条件，并用三氯生作为阳性对照、氨苄西林和浅蓝菌素作为阴性对照对该模型进行评价。

    结果获得了针对fabI的反义工程菌，确定了最适 IPTG浓度为 40 μmol/L，成功构建了 FabI 特异性酶抑制剂的超敏全细胞筛选模型，并验证了其可行性。应用该筛选模型对5847 个内生真菌次级代谢产物进行活性筛选，初筛阳性率约为 9.7%，经复筛后获得 8 份阳性样品。

    结论成功建立了基于反义 RNA 沉默技术的 FabI 超敏全细胞筛选模型，并利用该模型筛选到 8 份阳性样品。

    RNA，反义； 药物评价，临床前； 烯脂酰-ACP 还原酶

    反义 RNA 技术可以在转录或翻译水平沉默靶基因，选择性控制靶基因的蛋白表达量，从而使所构建反义菌株对外界特异性抑制剂非常敏感。该技术已经成功用于抗菌药物筛选模型的构建，并筛选获得了能够有效抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐万古霉素肠球菌(VRE)的平板霉素[6-7]。本文应用反义 RNA 技术构建针对 FabI的反义Escherichi coli工程菌，以此构建靶向 FabI的全细胞筛选模型，并将该模型用于筛选植物内生菌代谢产物的活性组分。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株、质粒及连接酶E.coliDH5α、E.coliBL21、E.coliTOP10 菌株由本实验室保藏；质粒pHN678(携带 paired termini 结构)由英国皇家兽医学院 Liam Good 实验室赠送；PCR 产物纯化和凝胶回收试剂盒购于杭州爱思进生物技术公司；T4 DNA 连接酶、PrimeStar HS DNA 聚合酶和各类内切酶均购自宝生物工程(大连)有限公司。

    1.1.2 仪器 680 型酶标仪为美国 Bio-Rad 公司产品；棱光 UV762 紫外/可见分光光度计为上海精密科学仪器有限公司产品 ......