蔡俊立，胡泽斌，沈毅珺

    基因编辑技术在CHO工程细胞株改造中的应用研究进展

    蔡俊立，胡泽斌，沈毅珺

    基因编辑技术是近几年迅速发展起来、可实现对基因组进行靶向精确修饰的一种生物技术，通过该技术可对基因进行定位突变、插入或敲除。从最初应用的锌指核酸酶(zinc-finger nucleases，ZFNs)到转录激活样效应因子核酸酶(transcription activator-like effectors nucleases，TALENs)，再到近两年愈加火热的 CRISPR/Cas9 系统，随着新基因编辑工具的不断发掘，对基因组进行定向改造的工作将变得更加高效精准、方便快捷[1]。

    基因编辑工具可实现在基因组特定位点 DNA 双链断裂，随后，断裂的 DNA 双链将主要通过两种分子机制进行修复，机制 1：同源重组修复(HDR)即损伤的 DNA 使用同源 DNA 序列作为模板进行修复；机制 2：非同源末端连接修复机制(NHEJ)即非同源 DNA 片段断裂末端彼此连接[2-3]。目前基因编辑工具主要应用于对特定基因的敲除(knock out)/敲入(knock in)，而对基因敲低(knock-down)的研究甚少[1]。

    在现代生物制药产业中，哺乳动物细胞是最为常用的宿主细胞，尤其是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary，CHO)，常用于生产各种具有重要药用价值、并具有复杂翻译后修饰的蛋白，如治疗性单克隆抗体等[4-5]。目前，CHO 已成为各大跨国制药公司生产单克隆抗体药物的首选宿主细胞。但在药物研发过程中，如何得到高表达且产物质量稳定一致的工程细胞株是巨大挑战之一。而使用新型基因编辑工具可方便快捷地改造甚至设计出理想的工程细胞株用于商业化生产。以下将概述目前三大主流基因编辑工具(重点介绍 CRISPR/Cas9 技术)在 CHO 工程细胞株改造方面的应用进展。

    1 ZFNs 技术

    锌指核酸酶(ZFNs)是经过人工改造的核酸酶，它由锌指蛋白(ZFP)和 FokI 核酸内切酶构成，其中锌指蛋白来源于真核细胞转录子，可特异性识别基因组位点并与特定DNA 片段结合，而 FokI 是一种来源于 Flavobacterium okeanokoites 的核酸内切酶，负责在特定位点将 DNA 片段切割[6-7]。

    1.1 快速筛选高表达 CHO 工程细胞株

    ZFNs 技术已成功应用于 CHO 工程细胞株的定向改造。为了快速高效地筛选出高表达量细胞株 ......