李盼盼，胡佳楠，左利民，朱志玲，姚静，山广志

    柱前衍生HPLC法研究亮菌口服溶液中游离氨基酸和总氨基酸含量

    李盼盼，胡佳楠，左利民，朱志玲，姚静，山广志

    100050 北京，中国医学科学院医药生物技术研究所分析测试中心(李盼盼、胡佳楠、左利民、朱志玲、山广志)；100050 北京，中国食品药品检定研究院抗肿瘤与放射药品室(姚静)

    亮菌口服溶液是由真菌——假蜜环菌发酵提取而制得的一种多组分药物，其成分复杂，内含亮菌素、多糖、氨基酸、蛋白质等多种成分，具有解痉、镇痛、消炎、退黄疸以及降低谷丙转氨酶、γ-谷氨酰转肽酶和胆红素等作用，主要用于治疗慢性肝炎，迁延性肝炎，慢性胆管炎，胆囊炎以及慢性、浅表性、萎缩性胃炎，还可用于放疗、化疗引起的白细胞减少的辅助治疗。亮菌口服溶液富含游离氨基酸和蛋白，建立和考察亮菌口服溶液中游离氨基酸及蛋白质，有助于提升和完善该品种的质量标准，揭示其药效成分。

    目前多肽、蛋白的测定方法主要有双缩脲法、Folin-酚试剂法、紫外吸收法等。但由于亮菌口服液成分复杂，干扰物质多，很难通过显色法测定。

    现有氨基酸测定方法主要包括氨基酸衍生仪法[1-2]、离子色谱法[3]、柱前衍生法[4-7]、气相色谱法[8]及其他方法[9]。前两种方法需要专门仪器，普适性差。柱前在线衍生高效液相色谱法简单、重复性好，是目前氨基酸测定最常用的方法。

    本实验利用蛋白质在酸性条件下水解为氨基酸，通过柱前在线衍生高效液相色谱法测定水解后总氨基酸以及未水解的游离氨基酸含量，间接评估亮菌口服溶液中蛋白含量。经方法学验证，本法重复性好，专属性强，对全面评估亮菌口服溶液中总氨基酸及游离氨基酸水平具有重要意义。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 仪器 Agilent 1200 型液相色谱系统为美国 Agilent 公司产品，配有在线脱气机、四元梯度泵、自动进样器、柱温箱和二极管阵列检测器；Chromeleon 7.2 色谱工作站为美国 Thermo Fisher Scientific 公司产品；ME204 型万分之一电子分析天平、XP205 型十万分之一电子分析天平和 Seven easy pH 计均为瑞士Mettler Toledo 公司产品； Milli-Q Integral 型超纯水机为德国 Merck Millipore 公司产品。

    1.1.2 药品与试剂 17 种氨基酸混合对照溶液购自美国 Agilent 公司(批号BCBS9033V ......