张苗青，胡昌勤，张靖溥

    滴眼液是直接用于眼部发挥治疗眼部疾病的无菌制剂。为更好地保护滴眼液，防止在使用和保存过程中被微生物污染，多种滴眼液中均加有防腐剂。防腐剂会对眼部产生刺激，长期用药会产生局部毒副作用[1]。苯扎溴铵和羟苯乙酯为滴眼液中最常用的防腐剂。苯扎溴铵是由溴化二甲基苄基烃铵同系物所组成的混合物，广泛用作抑菌剂[2]。羟苯乙酯，化学名为对羟基苯甲酸乙酯，是尼泊金酯类防腐剂，具有广谱的抑菌作用。有研究表明，长期使用含苯扎溴铵或羟苯乙酯的滴眼液对眼部有不同程度的损伤，导致眼部不适、过敏、纤维化、结膜鳞状化、角膜厚度变化以及炎症等症状[3-6]。至今，有效的快速评价化合物致眼损伤的体内模型尚未见报道。

    近年来，斑马鱼凭借其繁殖周期短，使用药物量少、遗传水平与人类相似、个体小、胚胎透明、便于显微操作等优势，被广泛用于药物筛选和安全性评价的疾病模型。斑马鱼的视觉系统与包括人类在内的其他脊椎动物非常相似，例如其视网膜和晶状体的形态和结构，以及其在受精后第5 天(days post fertilization，dpf)后就具有视觉功能，因此斑马鱼眼睛可作为较好的视觉模型，受到视觉科学研究领域的广泛关注[7-8]。

    本研究以苯扎溴铵和羟苯乙酯为探针药物，建立药源性斑马鱼眼损伤模型，并探讨苯扎溴铵和羟苯乙酯诱导斑马鱼眼损伤的作用机制。以期为评价这两类化合物类似物的眼毒性提供理论依据和评价参照标准，并为快速评价化合物的眼毒性提供体内模型。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 实验动物 斑马鱼野生型 AB 系，饲养温度为(28.5 ± 1)℃，光照条件为 14 h 光照/10 h 黑暗，饲养液的电导率为 500～550 μS/cm。斑马鱼幼体的获得：取野生型斑马鱼成鱼雌雄各两条交配，收集受精卵，清洗后，挑选表型正常的受精卵养殖在斑马鱼饲养液中，待发育至 3 dpf 用于后续实验。本实验程序符合中国医学科学院医药生物技术研究所的动物实验伦理规则，并获得所实验动物管理委员会的准许。

    1.1.2 试剂 苯扎溴铵(浓度为 10.9 mg/ml)和羟苯乙酯标准品(纯度为 99.9 %)来自中国食品药品检定研究院；4% 多聚甲醛(PFA)购自北京普利莱基因技术有限公司；pGEM-T 载体和 M-MLV反转录酶购自美国 Promega 公司；地高辛 RNA标记试剂盒购自瑞士 Roche 公司；Trizol 试剂购自美国 Invitrogen 公司。

    1.2 方法 ......