程艳，万婷婷，薛荣亮

    ·论著·

    PTD4-Cu,Zn-SOD原核重组表达载体优化及蛋白表达

    程艳，万婷婷，薛荣亮

    710068 西安，陕西省人民医院麻醉科(程艳)；710100 西安，西安国际医学中心医院麻醉与舒适化医疗中心(薛荣亮)；100191 北京，北京大学第三医院麻醉科(万婷婷)

    优化PTD4-Cu,Zn-SOD 原核重组表达载体以增加 SOD 融合蛋白表达。通过基因工程设计引物并优化PTD4-Cu,Zn-SOD 原核重组表达载体，扩增并鉴定目的基因，将优化后的原核重组表达载体以热激法转化至BL21(DE3) 中，通过 IPTG 诱导重组载体进行蛋白表达，通过溶菌酶 + 超声裂解菌体，离心后收集上清，利用 Ni-NTA 树脂纯化，10 kD，20 kD 透析袋浓缩，以获得 SOD 融合蛋白。利用 SDS-PAGE 凝胶电泳及 Western blot 鉴定 SOD 融合蛋白。采用 BCA 与黄嘌呤氧化酶法测定 SOD 融合蛋白浓度及活力。优化后的重组表达载体优化了稀有碱基，增加了 His·Tag 标签，His·Tag-PTD4-Cu,Zn-SOD 序列作为一个整体，在I 与H I 限制性内切酶作用下定向插入，构建了长度为 6213 bp 的优化质粒，基因测序结果与预先设计的序列对比显示碱基序列正确。优化后的 SOD 融合蛋白表达量约占菌体的 32%，较前(20%)提高，纯化浓缩后纯度为 94%，较前(90%)增加。测定浓度为 1.8 mg/ml，37 ℃时 SOD 总活力为(3065.137 ± 19.75)U/mg prot。通过重组表达载体密码子优化，可以获得高产量、高活性的 SOD 融合蛋白。

    蛋白质结构域； 超氧化物歧化酶； 质粒

    过氧化反应与多种神经退行性疾病关系密切，其产生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)是造成神经元死亡的主要原因。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是针对 ROS 的主要抗氧化剂防御系统，但其分子量大且无特异性受体，难以穿过血脑屏障及细胞膜进入脑内发挥作用。蛋白质转导结构域(protein transduction domain，PTD)是一个以肽为载体的能够有效运输各种物质进入细胞和细胞核的系统，能够把生理状态下不能进入细胞发挥生物效应的物质带入细胞的载体工具[1]。PTD-4 结构域的二级结构具有双亲性，因而具有高效且快速的细胞转导能力[2]。

    大肠杆菌原核表达体系是基因表达技术中发展最早 ......