赵慧霞 李秋文 董伟伟 段昕妤 朱建华 王如良 郝怡鑫 叶 明 肖文华

    解放军总医院第一附属医院肿瘤科，北京 100048

    NDRG4(N-myc downstream-regulated gene 4)为抑癌基因NDRG基因家族成员[1]，该基因家族在人体多种其他正常组织中高表达，在某些肿瘤组织中不表达或低表达，低表达则可能与启动子高甲基化相关。大肠癌(colorectal cancer，CRC)是临床最常见的恶性肿瘤之一[2-3]，在我国其发病率呈上升态势，且晚期患者预后很差，5年总体生存率不到 15%，然而有关NDRG4基因与启动子甲基化状态在结直肠癌中的作用尚未得到阐明[4]。DNA甲基化常常是肿瘤发生发展过程中的早期事件，因此，特异基因的甲基化可作为肿瘤早期诊断的分子标志物。近年来研究认为NDRG4基因存在于CRC肿瘤组织和体液中，且可能具有稳定性高、可重生性，这为提高CRC的早期筛查[5-6]、早期诊断提供了一个全新的视角。本研究采用巢式甲基化特异性PCR(nested methylation specific PCR，nMSP)检测结直肠癌血、尿、粪便NDRG4基因启动子区甲基化状态。比较结直肠癌组织与粪便、尿、血中的NDRG4甲基化在早期诊断中的敏感性和特异性及其与结直肠癌临床病理特征之间的关系，以探讨其在结直肠癌早期诊断中的应用价值。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 标本收集

    取我院普外科2010年6月～2011年8月手术切除的84例患者的结直肠癌、癌旁组织，均经病理证实；年龄为36～81岁，平均年龄53岁。并同期选择相匹配的正常对照者30例(腹股沟疝患者和下肢静脉曲张患者)。全部受检者空腹抽血2 mL，EDTA-2Na 抗凝；同时留取晨尿 50～100 mL，粪便 100～200 mg，血、尿液、粪便标本于手术前收集，收集后30 min内送实验室。血、尿液、粪便立即提取基因组DNA，置于-20℃冻存备用。大肠癌患者术后立即取材，癌组织、癌旁组织标本，分装并-80℃保存。所有患者在术前均未接受过化疗、放疗及免疫治疗，所有研究对象均知情同意并签署知情同意书。

    1.1.2 主要试剂与仪器

    组织DNA提取试剂盒：组织基因组DNA提取试剂盒(天根公司)；粪便DNA提取试剂盒：stool DNA Extraction Kit(Bioneer公司)；血DNA提取试剂盒：天根全血基因组DNA提取试剂盒、血浆游离DNA纯化试剂盒(天根公司)；尿液DNA提取试剂盒：尿液基因组DNA快速提取试剂盒；亚硫酸盐处理试剂 ：Wizard DNA Clean-up system、EZ DNA Methylation TM-Direct Kit(Promega 公司)；X-SssⅠ内 切酶(英国NEB公司)；对亚硫酸氢盐转化的DNA进行全基因组扩增试剂盒：EpiTect Whole Bisulfitome Kit(德国Qiagen公司)；PCR 扩增试剂：HotstarTaq DNA polymerase(德国 Qiagen公司) ......