温 昱 李 彬

    1.中国医科大学基础医学院组织胚胎学教研室，辽宁沈阳110122；2.中国医科大学附属盛京医院运动医学教研室，辽宁沈阳110022

    体外诱导小鼠骨髓CD45-细胞向窦房结起搏样细胞定向分化

    温 昱1李 彬2

    1.中国医科大学基础医学院组织胚胎学教研室，辽宁沈阳110122；2.中国医科大学附属盛京医院运动医学教研室，辽宁沈阳110022

    目的探讨体外诱导小鼠骨髓CD45-细胞向窦房结起搏样细胞定向分化的方法。方法免疫磁珠分选小鼠骨髓CD45-细胞，体外培养扩增后，采用添加了5-氮胞苷和小鼠窦房结组织培养上清液的诱导培养基培养，经免疫荧光染色检测起搏样细胞标志物神经丝蛋白-160(NF-160)和超级化激活环核苷酸门控阳离子通道(HCN)4表达，并采用qRT-PCR定量检测起搏基因NF-160、HCN4和HCN2表达。结果小鼠骨髓CD45-细胞经体外诱导培养后得到的分化细胞表达NF-160和HCN4；qRT-PCR分析显示，与体外培养的小鼠窦房结细胞比较，分化起搏样细胞NF-160和HCN4的表达升高，HCN2的表达降低。结论体外培养能够将小鼠骨髓CD45-细胞诱导分化为窦房结起搏样细胞，为构建生物起搏器种子细胞提供选择。

    起搏样细胞曰CD45曰HCN4曰NF-160曰窦房结

    心律失常是常见病，严重将危及患者生命。目前，对于严重心律失常、病态窦房结综合征患者，安装心脏起搏器是理想的治疗方法[1-3]。随着生物学及干细胞研究的发展，利用其相关技术逐步构建生物起搏器，对受损心传导系统的组织进行修复或替代，尤其是窦房结功能重建，可以使心脏的起搏和传导功能得以修复[4-5]。构建生物起搏器的种子细胞目前以干细胞为主[6-7]。由于骨髓源干细胞具有多向分化潜能，可自体获得，并能够在体外扩增，是比较理想的种子细胞，所以本研究采用5-氮胞苷联合窦房结细胞培养上清液体外诱导培养骨髓CD45-细胞，探讨其分化为起搏样细胞的可能性。研究周期为2014年8月～2015年1月，旨在为临床因窦房结起搏细胞数量减少或功能衰退造成的心传导系统功能障碍、严重心律失常等疾病的替代治疗以及生物起搏技术的应用奠定实验基础。

    1 材料与方法

    1.1 实验动物尧仪器和试剂

    1.1.1 实验动物选取昆明小鼠10只，雌雄不限，4～5周龄，体重20～30 g，常规饲养，健康。

    1.1.2 主要仪器和试剂低糖DMEM和胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自Hyclone；DMEM-F12购自Gibco；5-氮胞苷(5-azacytidine)购自Sigma；兔源HCN4一抗、小鼠来源NF-160一抗和TRITC标记山羊抗兔IgG购自Abcam；FITC标记山羊抗小鼠IgG和DAPI购自武汉博士德生物工程有限公司；RNA extraction kit购自Qiagen；PCR引物购自生工生物工程(上海)有限公司；SYBR Green Real Time-PCR Master Mix购自Invitrogen ......