胡安全 冯祁军 王正安 秦 力 李 哲

    浙江省嘉兴市第一医院骨科，浙江嘉兴 314000

    周围神经损伤多见于高能量暴力损伤患者[1]，尤其以坐骨神经损伤最难处理且术后恢复缓慢，这与周围神经的再生和修复能力有限、功能恢复差有关。目前骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)已经成为组织工程、细胞治疗领域理想的种子细胞[2-3]，尤其可用于周围神经损伤的再生细胞治疗[4]。但是由于干细胞移植在体内的存活率和分化率不理想，患者很难获得理想的临床效益[5-7]。为了提高BM-MSCs 移植对坐骨神经损伤的再生与修复作用，本研究在体外通过不同的诱导方法定向诱导BM-MSCs 向神经元样细胞分化，并进一步通过大鼠坐骨神经损伤模型，以证实在体外定向诱导为神经元样BM-MSCs 有促进大鼠神经损伤恢复和神经递质分泌的作用。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    12 只SPF 级4 周龄雄性SD 大鼠(175±10)g 和90 只SPF 级3 月龄雄性SD 大鼠(225±25)g 购自浙江维通利华实验动物技术有限公司[许可证号：SCXK(浙)2019-0001]，动物房温度(22±1)℃，湿度(50±5)%，适应性喂养1 周后进行实验，实验过程中遵循“3R”原则。

    BriCyte E6 型流式细胞仪购自深圳迈瑞医疗公司；β-巯基乙醇(货号：0482-250ML)和全反式视黄酸(货号：C20734-100mg)购自美国Sigma 公司；免疫印迹一抗脑源性神经营养因子(BDNF)(货号：ab108319)、髓磷脂碱性蛋白(MBP)(货号：ab20216)和生长关联蛋白43(GAP-43)(货号：ab75810)购自英国Abcam 公司。

    1.2 BM-MSCs 分离培养及鉴定

    取12 只4 周龄大鼠，窒息处死。参照Maridas 等[8]、Huang 等[9]方法取大鼠双侧股骨及胫骨分离骨髓细胞。细胞培养用常规细胞贴壁筛选法，通过多次1∶1传代在体外进行纯化。取1.0×106个/mL P3 代细胞加入适量鼠抗人抗体CD29、CD44、CD90 免疫荧光鉴定，流式细胞仪检测BM-MSCs 表面标志物。

    1.3 BM-MSCs 定向诱导和分化

    将BM-MSCs 细胞分为化学诱导分化组(β-巯基乙醇组和全反式视黄酸组)、Transwell 小室共培养组和对照组(不作处理)。化学诱导分化组按1.0×105个/mL浓度接种于盖玻片上，用低糖DMEM 培养基培养 ......