高效液相色谱法测定复方虎杖片中大黄素的含量
 |
 |
【摘要】 目的 建立用高效液相色谱法测定复方虎杖片大黄素含量的方法。方法 用phenomenexprodigy ODS3(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液(85∶15)，流速：1.0 ml/min，检测波长：254 nm，进样量为5 μl。结果 对照品线性范围为12.02～72.14 μg /ml，平均回收率为100.69%， RSD=1.42%(n=6)。结论 该方法简便可行，重复性好，能有效控制复方虎杖片的质量。
【关键词】复方虎杖片； 大黄素； 高效液相色谱法
复方虎杖片原标准收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第三册，只有鉴别、检查项目，专属性差；没有建立含量测定方法，属国家药品标准提高行动计划品种。该品种由虎杖提取物、功劳木提取物、枇杷叶提取物组成，具有清热、祛痰、止咳、平喘，用于慢性支气管炎。因虎杖提取物在成药之中所占比重较大，主要活性成分有大黄素、大黄素甲醚、大黄酚、芪三酚、芪三酚苷等。由于产地不同，采挖季节不同，主要成分的含量也有很大的差别，同时芪三酚、芪三酚苷未有符合含量测定要求的对照品，因此，为控制其质量，本实验采用高效液相色谱法测定其大黄素的含量，以其作为指标性成分，从而达到控制产品质量的目的。
1 仪器、试剂与样品
仪器：TU-1901 紫外可见分光光度计，sartorius CP225D 电子分析天平，岛津LC-2010A全自动高效液相色谱仪，Lcsolution 工作站，KQ-400KDB 数控超声波清洗器。
对照品：大黄素对照品(批号：110756-200110中国药品生物制品检定所，供含量测定用，纯度为100.00%，符合定量测定要求)。
试剂与样品：甲醇为色谱纯，水为高纯水，其他制剂均为分析纯。复方虎杖片及缺虎杖的阴性对照样品(广西河丰药业有限公司提供)。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱 phenomenexprodigy ODS3(250 mm×4.6 mm，5μm)，流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液(85∶15)[1,2]，流速：1.0 ml/min，检测波长：254 nm，柱温：30℃。理论塔板数(n)按大黄素峰计算，应不低于9000，进样量为5 μl。
2.2 对照品溶液的制备 精密称取五氧化二磷减压干燥24 h大黄素对照品适量，加甲醇制成每1 ml含0.5 mg的备用溶液，作为对照品贮备液。另精密量取贮备液适量，加甲醇制成每1 ml含30 μg的溶液，作为对照品溶液，即得。
2.3 供试品溶液的制备 取本品，除去包衣，研细，混匀，取0.1 g，精密称定，加0.5 mol/L硫酸溶液20 ml，加氯仿30 ml，80℃水浴回流2.5 h，分取氯仿层，酸液用氯仿提取3次，每次10 ml，合并氯仿提取液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，置25 ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。精密量取2 ml，置10 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
2.4 阴性样品溶液的制备 取阴性样品，按2.3项方法制备阴性样品溶液。
在上述色谱条件下,分别进样对照品、供试品、阴性样品各5 μl，大黄素保留时间约为9 min，阴性样品对测定无干扰。见图1~3。
2.5 线性关系考察 精密称取大黄素对照品10.02 mg，置100 ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1.2、2.4、3.6、4.8、6.0、7.2 ml，分别置10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，精密吸取上述溶液各5 μl，分别注入液相色谱仪，测定，记录峰面积，以峰面积(Y)对浓度(X)作图，得标准曲线，计算回归方程：Y=1.8248×104X-1.8952×102，r=0.9999，结果表明：大黄素在12.02～72.14 μg /ml线性范围内，浓度与大黄素峰面积呈良好的线性关系。见图4。
2.6 精密度试验 取同一供试品溶液，重复进样6次，记录峰面积，结果RSD为0.14%。
2.7 重复性试验取同一批样品6份，按上述方法测定大黄素的含量，结果RSD为1.26%。
2.8 稳定性考察 取“2.7”项下供试品溶液，在0，4，8，12，16，20，24 h分别进样5 μl，记录峰面积，结果峰面积的RSD为0.19%，表明供试品溶液在24 h内均稳定。
2.9 加样回收率试验 精密称取同一批次(061201批)样品，(大黄素含量为8.6578 mg/片，平均每片重为0.2624 g)约0.05 g。共取6份样，分别精密加入大黄素对照品储备液1.5 ml，按上述方法测定，计算加样回收率。结果平均回收率为100.69%，RSD=1.42%(n=6)，符合定量分析的要求，详见表1。
3 样品测定
按上述含量测定方法，测定10批样品中大黄素的含量，结果见表2。
4 讨论
4.1 本品主要成份游离蒽醌衍生物，不溶于水，溶于乙醇、乙醚、氯仿、苯等。当用氯仿等有机溶剂从水溶液中萃取游离蒽醌衍生物时必须加酸酸化使之处于游离状态。从参考资料上得知，大多都以苯-硫酸或氯仿-硫酸为溶媒提取。本实验将氯仿、苯的提取结果进行比较，结果氯仿对大黄素的选择性较好，在HPLC色谱图上杂质峰较少，易于分离。而且苯毒性太大。因此，采用以氯仿-硫酸为溶媒进行提取。
4.2 用浸泡、超声、加热回流三种方法对大黄素的提取进行了考察，实验表明，在相同的条件下，浸泡方法所测得含量最低；采用超声方法提取时，溶液乳化现象较严重，有浑浊现象，而且所测得含量较低；采用加热回流提取方法，效果最好。
参考文献
[1] 方彬，吕凤莲，刘传珍，等.高效液相色谱法测定虎杖中大黄素的含量.中国药事，2005，19(2)：106-107.
[2]中华人民共和国药典委员会编.中国药典.化学工业出版社，2005：145., 百拇医药(石天松 覃忠于 莫文电 戴丽群 韦建乔 覃丽郦)