全反式维甲酸诱导小鼠间充质干细胞C3H10T1/2表达碱性磷酸酶(2)
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图1 ATRA诱导C3H10T1/2细胞中ALP的活性显著上调(钙钴染色,100×)
2.2 ATRA诱导ALP表达的量效关系与动力学特征
采用定量RT-PCR的方法检测C3H10T1/2细胞中ALP表达的情况,发现10-4M至10-8M ATRA诱导24 h时都有上调ALP转录的作用,但较高ATRA浓度时反而导致增加趋势有所下降,可能是ATRA浓度较大时有一定的毒性作用。从时间分布来看,诱导1 h,ALP转录即开始迅速增加,12 h基本达到峰值,上调16倍左右,以后转录水平不再增加,维持较高的水平,而C2C12、MC3T3-E1细胞中检测不到ALP的变化(图2A)。由于ALP上调开始较早,我们推测可能是RA通路的直接作用,使用蛋白合成抑制剂CHX首先处理C3H10T1/2 30 min后,10-6M ATRA处理,发现ALP的表达上调仍然十分明显(图2B),表明ATRA上调ALP的作用是不依赖于蛋白质合成的直接作用。
图2 ATRA诱导ALP转录的量效关系与时间动力学变化
注:A. 定量RT-PCR检测不同浓度ATRA诱导C3H10T1/2、MC3T3-E1、C2C12细胞中ALP的转录情况(n=3);B. 定量RT-PCR检测ATRA上调ALP表达的时间动力学变化以及CHX对ATRA上调ALP转录水平的影响 (n=3)
2.3 ATRA上调ALP的作用与信号通路的关系
由于RA的主要信号途径是核受体的经典基因组途径,同时考虑到ATRA不会结合RXR型受体,因此我们采用RAR受体通用激动剂Ch55处理C3H10T1/2细胞,发现单独使用Ch55也能够明显上调ALP的转录。另外,近年来的研究表明ATRA能够激活一些非基因组的快速磷酸化途径,主要是MAPK通路,我们运用JNK阻滞剂SB600125、ERK阻滞剂PD98059、p38阻滞剂SB203580与ATRA共处理C3H10T1/2细胞,发现ALP的转录上调趋势未受影响,因此我们认为ATRA上调ALP的作用由RAR直接介导,与MAPK的快速磷酸化途径无关(图3)。
图3ATRA上调ALP转录与RA信号通路的关系
注:1 ......
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