黄芪中黄芪总皂苷的大孔树脂纯化工艺研究(1)
【摘要】 目的优选出分离纯化黄芪中黄芪总皂苷的最佳工艺条件。 方法采用动态吸附解析法,用超高效液相色谱法测定黄芪甲苷的含量,优选出最佳纯化条件。 结果D101树脂对黄芪总皂苷的纯化最优,以2 BV/h吸附速率吸附,5 BV 70%乙醇以3 BV/h的流速进行洗脱效果最佳,黄芪甲苷的精制度为446.28%。 结论D101大孔吸附树脂可用于黄芪总皂苷的纯化。
【关键词】黄芪;黄芪总皂苷;大孔树脂
Purification of total saponins of Astragalus in Radix Astragali
SUI Yulan,LI Zhaoyi.People’s Hospital of Jining,Shandong Jining 272000,China
【Abstract】 ObjectiveTo optimize the technological parameter of purification of the astragalosideⅣ. MethodsWith the extraction rate of the astragalosideⅣ,the optimized technological parameter was selected by UPLC. ResultsD101 was found to provide the best fit of separation and purification,take the best condition of 2BV/h current velocity,70%ethanol as the eluting reagent,and the eluting velocity was 3 BV/h.This method made the astragalosideⅣ have a refined degree of 446.28%. ConclusionD101 resin could be used to refine the astragalosideⅣ in Radix Astragali.
, http://www.100md.com
【Key words】
Radix Astragali; Total saponins of Astragalus; Macroporous resin
黄芪为豆科植物蒙古黄芪 Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪 Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根[1],其主要成分为黄芪总皂苷,具有广泛的药理作用,如强心、抗胃溃疡、对外周神经系统的再生具有双重调节作用、降血压等作用[2-5]。本文以黄芪甲苷为指标对黄芪中黄芪总皂苷的纯化进行了研究,为以后黄芪的进一步开发做基础。
1 材料与仪器
黄芪甲苷对照品(中国药品生物制品检定所,批号110781200613);黄芪药材(浙江中医药大学中药饮片厂),经浙江中医药大学资源鉴定教研室陈孔荣副教授鉴定为膜荚黄芪 Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根。化学试剂均为分析纯。D201、D101、DM130(天津南开大学化工厂)。赛多利斯分析天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司);RE52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂),Waters AcquityTMUltraperformance LC色谱仪、AcquityTMTUV检测器;
, 百拇医药
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱:ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);流动相:乙腈-水(35∶65); 漂移温度:50℃;流速:02 ml/min;柱温:30℃;氮气压力:45PSI。
2.2 对照品溶液的制备 精密称取黄芪甲苷对照品适量,用甲醇制成浓度为0066 mg/ml的溶液,作为对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备 取黄芪粗粉约3 g,精密称定,加甲醇24 ml加热回流2次,每次2 h,过滤合并滤液,减压回收并用甲醇定容至50 ml量瓶中,备用。
2.4 标准曲线的制备 取“2.2”项下的对照品溶液,分别进样05、1、1.5、2.0、2.5 μl,以对照品峰面积的常用对数值(Y)为纵坐标、进样量(μg)的常用对数值(X)为横坐标进行线性回归,得回归方程为Y=39921X16698( r =09997)。结果表明,黄芪甲苷进样量在0033~0165 μg范围内的对数值与峰面积对数值呈良好线性关系。
, http://www.100md.com
2.5 精密度实验 取2.2项下的对照品溶液进样,重复测定6次,每次进样3 μl,记录峰面积,计算得RSD为051%。
2.6 稳定性实验 按照“2.3”项下制备样品一份,分别于0 h、4 h、6 h、8 h、10 h进样,每次进样3 μl,依法测定,记录峰面积。计算得RSD为3.14%,表明样品在10 h内稳定。
3 上柱药液的制备
取黄芪粗粉约80 g,精密称定,加甲醇240 ml加热回流2次,每次2 h,过滤,合并滤液,减压回收甲醇并用纯净水定容至50 ml量瓶中,备用。
4 树脂的选择
称取预处理过的树脂各5 g于100 ml锥形瓶中,加入一定量供试品溶液,盖紧瓶塞,每隔10 min振摇20 s,持续2 h,静止放置24 h,过滤,测量滤液中黄芪甲苷含量,计算吸附率。将经静态吸附后的树脂水洗至无Molish反应(吸取1 ml清洗液,加5%α萘酚乙醇溶液3滴,摇匀。沿试管壁缓缓加入05 ml浓硫酸,如在试管与硫酸的交界面处,很快形成紫色环),加70%乙醇20 ml解吸,每隔10 min振摇20 s,持续2 h,静置24 h后,过滤得解析液,测定其黄芪甲苷含量,计算解析率。
, 百拇医药
表1
树脂的筛选
树脂型号 吸附率(%) 转移率(%)
D201 705 62.9
D101 92.8 89.2
DM130 88.3 84.8
表1表明,D101对柴胡皂苷和姜黄素的吸附率与转移率均最高,所以选用D101大孔树脂。
5 动态考察
5.1 动态吸附曲线的考察 取DM101树脂20 g(ф18 mm×40 cm)于柱内,精密吸取按上述方法制备的黄芪水溶液上柱,流速为3 BV/h,每20 ml收集为一流分,测量流出液中黄芪甲苷的含量。以流出液体积(ml)为横坐标,黄芪甲苷的量(mg)为纵坐标,分别绘制泄漏曲线,计算树脂吸附容量。树脂吸附量=泄漏点上样体积(ml)×样品浓度(mg/ml)
图1 动态泄露曲线
由图1可知,D101树脂的吸附饱和点为120 ml,即每克D101可吸附黄芪甲苷1.25 mg。
5.2 上柱药液浓度的考察 取D101树脂10 g,将上述样品(黄芪甲苷浓度为08 mg/ml)分别加水稀释成浓度为04、02、01 mg/ml的上样液,以2 BV/h的流速进行吸附,水洗,70%乙醇以3 BV/h的流速洗脱,收集洗脱液,测定黄芪甲苷的含量。, http://www.100md.com(隋玉兰 李兆翌)
【关键词】黄芪;黄芪总皂苷;大孔树脂
Purification of total saponins of Astragalus in Radix Astragali
SUI Yulan,LI Zhaoyi.People’s Hospital of Jining,Shandong Jining 272000,China
【Abstract】 ObjectiveTo optimize the technological parameter of purification of the astragalosideⅣ. MethodsWith the extraction rate of the astragalosideⅣ,the optimized technological parameter was selected by UPLC. ResultsD101 was found to provide the best fit of separation and purification,take the best condition of 2BV/h current velocity,70%ethanol as the eluting reagent,and the eluting velocity was 3 BV/h.This method made the astragalosideⅣ have a refined degree of 446.28%. ConclusionD101 resin could be used to refine the astragalosideⅣ in Radix Astragali.
, http://www.100md.com
【Key words】
Radix Astragali; Total saponins of Astragalus; Macroporous resin
黄芪为豆科植物蒙古黄芪 Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪 Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根[1],其主要成分为黄芪总皂苷,具有广泛的药理作用,如强心、抗胃溃疡、对外周神经系统的再生具有双重调节作用、降血压等作用[2-5]。本文以黄芪甲苷为指标对黄芪中黄芪总皂苷的纯化进行了研究,为以后黄芪的进一步开发做基础。
1 材料与仪器
黄芪甲苷对照品(中国药品生物制品检定所,批号110781200613);黄芪药材(浙江中医药大学中药饮片厂),经浙江中医药大学资源鉴定教研室陈孔荣副教授鉴定为膜荚黄芪 Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根。化学试剂均为分析纯。D201、D101、DM130(天津南开大学化工厂)。赛多利斯分析天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司);RE52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂),Waters AcquityTMUltraperformance LC色谱仪、AcquityTMTUV检测器;
, 百拇医药
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱:ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);流动相:乙腈-水(35∶65); 漂移温度:50℃;流速:02 ml/min;柱温:30℃;氮气压力:45PSI。
2.2 对照品溶液的制备 精密称取黄芪甲苷对照品适量,用甲醇制成浓度为0066 mg/ml的溶液,作为对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备 取黄芪粗粉约3 g,精密称定,加甲醇24 ml加热回流2次,每次2 h,过滤合并滤液,减压回收并用甲醇定容至50 ml量瓶中,备用。
2.4 标准曲线的制备 取“2.2”项下的对照品溶液,分别进样05、1、1.5、2.0、2.5 μl,以对照品峰面积的常用对数值(Y)为纵坐标、进样量(μg)的常用对数值(X)为横坐标进行线性回归,得回归方程为Y=39921X16698( r =09997)。结果表明,黄芪甲苷进样量在0033~0165 μg范围内的对数值与峰面积对数值呈良好线性关系。
, http://www.100md.com
2.5 精密度实验 取2.2项下的对照品溶液进样,重复测定6次,每次进样3 μl,记录峰面积,计算得RSD为051%。
2.6 稳定性实验 按照“2.3”项下制备样品一份,分别于0 h、4 h、6 h、8 h、10 h进样,每次进样3 μl,依法测定,记录峰面积。计算得RSD为3.14%,表明样品在10 h内稳定。
3 上柱药液的制备
取黄芪粗粉约80 g,精密称定,加甲醇240 ml加热回流2次,每次2 h,过滤,合并滤液,减压回收甲醇并用纯净水定容至50 ml量瓶中,备用。
4 树脂的选择
称取预处理过的树脂各5 g于100 ml锥形瓶中,加入一定量供试品溶液,盖紧瓶塞,每隔10 min振摇20 s,持续2 h,静止放置24 h,过滤,测量滤液中黄芪甲苷含量,计算吸附率。将经静态吸附后的树脂水洗至无Molish反应(吸取1 ml清洗液,加5%α萘酚乙醇溶液3滴,摇匀。沿试管壁缓缓加入05 ml浓硫酸,如在试管与硫酸的交界面处,很快形成紫色环),加70%乙醇20 ml解吸,每隔10 min振摇20 s,持续2 h,静置24 h后,过滤得解析液,测定其黄芪甲苷含量,计算解析率。
, 百拇医药
表1
树脂的筛选
树脂型号 吸附率(%) 转移率(%)
D201 705 62.9
D101 92.8 89.2
DM130 88.3 84.8
表1表明,D101对柴胡皂苷和姜黄素的吸附率与转移率均最高,所以选用D101大孔树脂。
5 动态考察
5.1 动态吸附曲线的考察 取DM101树脂20 g(ф18 mm×40 cm)于柱内,精密吸取按上述方法制备的黄芪水溶液上柱,流速为3 BV/h,每20 ml收集为一流分,测量流出液中黄芪甲苷的含量。以流出液体积(ml)为横坐标,黄芪甲苷的量(mg)为纵坐标,分别绘制泄漏曲线,计算树脂吸附容量。树脂吸附量=泄漏点上样体积(ml)×样品浓度(mg/ml)
图1 动态泄露曲线
由图1可知,D101树脂的吸附饱和点为120 ml,即每克D101可吸附黄芪甲苷1.25 mg。
5.2 上柱药液浓度的考察 取D101树脂10 g,将上述样品(黄芪甲苷浓度为08 mg/ml)分别加水稀释成浓度为04、02、01 mg/ml的上样液,以2 BV/h的流速进行吸附,水洗,70%乙醇以3 BV/h的流速洗脱,收集洗脱液,测定黄芪甲苷的含量。, http://www.100md.com(隋玉兰 李兆翌)