两种冻融方法对小鼠成熟卵母细胞冷冻效果的研究
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【摘要】 目的 探讨不同冷冻方法对成熟期(MⅡ)卵母细胞体外受精及胚胎发育能力的影响。方法 收集昆明小鼠MⅡ期卵母细胞，分别行玻璃化冷冻与程序化冷冻。解冻后比较两组复活率、受精率、卵裂率及囊胚形成率。结果 玻璃化冷冻法冷冻MⅡ期卵母细胞解冻后存活率显著高于程序化冷冻组的(80.1% vs.55.5%，P<0.01)，并且两组的囊胚形成率比较，差异有统计学意义(28.6% vs.19.4%，P<0.05)。结论 在进行卵母细胞冷冻保存时，玻璃化冷冻法冷冻效果好于程序冷冻法。
【关键词】小鼠；卵母细胞；玻璃化冷冻；胚胎发育
Study of the effect of different methods for mature oocytes cryopreservation in rats
LIU Xin-xiong.
Qinzhou Maternal and Child Health Hospital Fertility Center,Guangxi 53500，China
【Abstract】 Objective To explore the effect of different methods on in vitro fertilization(IVF)and embryonic developmental capacity of thawed metaphage Ⅱ(MⅡ)stage oocytes.Methods The oocytes on MⅡstage were collected,then were cryopreserved by programmed cryopreservation and vitrification cryopreservation.The thawed oocytes were cultured to observe the rates of survival,IVF,cleavage and bastocyst.Results The survival rate of oocytes by vitrification cryopreservation was significantly higher than those by programmed cryopreservation(80.1% vs.55.5%，P<0.01).There was also significant difference in the rates of bastocyst in different groups(28.6% vs.19.4%，P<0.05).Conclusion Vitrification cryopreservation is more effective in oocytes cryopreservation on MⅡstage.
【Key words】 Mouse；Oocytes；Vitrification；Embryonic development
卵母细胞冻存是辅助生育领域的研究热点之一，冷冻技术主要有程序化冷冻及玻璃化冷冻法。近年来由于冷冻技术和方法的改进，特别是玻璃化冷冻技术的发展，冻融卵母细胞的复苏率和受精率均有所提高，然而由于卵母细胞结构的特殊性，卵母细胞冷冻保存效果尚不理想[1，2]。本研究以小鼠MⅡ期卵母细胞为模型，应用程序化冷冻法与玻璃化冷冻法分别冷冻小鼠成熟期(metaphage Ⅱ，MⅡ)卵母细胞，比较两组卵母细胞解冻后的发育潜能,旨在为人卵母细胞的冷冻保存提供参考依据与理论。
1 资料与方法
1.1 一般资料 实验动物为购自广西医科大学实验动物中心昆明小鼠30只，体质量为25~35 g，饲养条件为光照14 h，黑暗10 h，小鼠可自由饮水、进食。
1.2 收集卵母细胞 小鼠适应性饲养一周后，于雌鼠腹腔内注射人绝经期尿促性腺激素(HMG)10 IU，48 h后注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)10 IU，16~18 h后颈椎脱臼法处死小鼠，收集有颗粒细胞的卵母细胞并将其置于80 IU/ml的透明质酸酶中，收集并选择形态正常、有第一极体的卵母细胞进行冷冻。
1.3 卵母细胞的冷冻与解冻 将收集的MⅡ期卵母细胞分别行程序化冷冻和玻璃化冷冻。程序化冷冻方法：冷冻和解冻均按照说明书进行操作。玻璃化冷冻方法：冷冻：先将卵子在PBS+15%胎牛血清(FCS)溶液中冲洗2~3次，再移入10% 乙二醇(EG)+10%二甲基亚砜(DMSO)溶液中停留30s，然后移入20%EG+20%DMSO+0.5 mol/L蔗糖溶液中，用OPS管通过虹吸作用将卵吸入管中，投入液氮。解冻：依次将卵子移入含0.5 mol/L、0.25 mol/L、0.1 mol/L的蔗糖溶液中，各停留3 min。再移到培养液中冲洗3~4次，然后将细胞质结构正常、透明带完整、周围间隙小的卵母细胞移入培养液中，放入5 %CO2培养箱中培养。
1.4 体外受精及培养
在受精当天,选用性成熟的成年雄性昆明小鼠，颈椎脱臼处死后，刺破附睾尾部，获得的精液悬浮液置37 ℃培养箱中培养1~2 h获能后，以5×106/ml的终浓度进行授精。6~9 h后显微镜下镜检，观察受精情况(见第二极体或双原核的卵判为已受精)，将受精卵移入卵裂培养液培养皿中，置于二氧化碳培养箱中培养，每天观察受精卵的发育情况并记录。
1.5 统计学方法 采用SPSS 10.0 统计软件对数据进行处理，计数资料采用χ2检验，P<0.05 表示差异有统计学意义。
2 结果
解冻后，采用玻璃化冷冻法冷冻的MⅡ期卵母细胞复活率为80.1%，显著高于程序冷冻法组的55.5%(P<0.01)。解冻后卵母细胞的囊胚形成率分别为28.6%和19.4%，差异有统计学意义(P<0.05)。两组受精率、卵裂率相比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。
3 讨论
卵母细胞冷冻是辅助生育技术(assisted reproductive technology,ART)领域的研究热点之一。1986年全世界第一例通过冻存卵母细胞获得试管婴儿成功降生，然而由于卵母细胞体积大、细胞膜与细胞浆比例小等自身生物学特点[3]，卵母细胞冷冻发展较慢，目前临床上尚未广泛应用，仅局限于实验研究。卵母细胞冷冻技术主要有程序冷冻与玻璃化冷冻。程序化冷冻法是将胚胎放置在一定浓度的冷冻保护液内，程序冷冻仪运行预设的程序缓慢降温使细胞逐步实现脱水，当达到预设定温度后快速投入液氮而达到冷冻保存的目的。程序化慢速冷冻法是一种有效的方法，但无法避免冻融过程中冰晶形成对胚胎的损伤。玻璃化冷冻是一种快速冷冻技术，可使细胞迅速通过“危险温度区”，降低细胞对低温的敏感性，使其从液态直接变为无结构的玻璃状态，从而保持溶液状态的分子和离子分布，避免冰晶的形成，减少了细胞的机械性损伤，使细胞得以在降温过程中保持结构的完整。
本研究分别采用程序化冷冻法和玻璃化冷冻法保存小鼠MⅡ期卵母细胞 ......
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