酶联免疫吸附试验检测人血浆中纤维蛋白原含量
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【摘要】 目的 探讨酶联免疫吸附试验在检测人血浆中纤维蛋白原含量中的应用价值。方法 采用竞争抑制ELISA法测定人血浆中纤维蛋白原含量，并探索凝血酶、第二抗体最佳稀释倍数及适宜反应时间。在最适宜条件下测定人血浆中纤维蛋白原含量。结果 第二抗体稀释1000倍为适宜的稀释倍数，10 IU/ml为最适宜凝血酶作用浓度，室温1.5 h为较理想的作用条件。FPA标准品稀释至60 ng/ml，20 ng/ml，5 ng/ml，回收率分别为107.2%、98%、110%。结论 用建立起来的竞争抑制性ELISA法测定人血浆蛋白原中，纤维蛋白肽A的含量，回收率高，操作简单方便，值得推广应用。
【关键词】酶联免疫吸附试验；血浆；纤维蛋白原；检测
纤维蛋白原(fibrinogen，FIB)为肝脏合成的一种重要的血浆糖蛋白，是由健康人血浆分离，经提纯冻干制成。可提高血中纤维蛋白原浓度，促进血液凝固进而止血，缺乏、消耗过多或纤维蛋白酶亢进易导致凝血障碍。临床多用于妊娠中毒、死胎、产后出血、胎盘早期剥离、大手术、严重大出血等所引起的纤维蛋白原缺乏导致的凝血障碍。血浆中纤维蛋白原检测方法按原理可分为热/盐沉淀法，可凝固蛋白法和免疫法[1]。纤维蛋白原释放纤维蛋白肽A(FPA)的能力可反映纤维蛋白原分子结构、生物学功能完整性。本研究采用竞争抑制ELISA法测定FPA浓度，为检测纤维蛋白原生物学活性唯一方法。
1 资料与方法
1.1 一般资料 (1)0.05 mol/L PH9.6碳酸盐缓冲液包被液(2)0.01 mol/L PH7.4PBS-Tween 20稀释液(3)洗涤液，同稀释液(4)10%BSA封闭液(5)TMB工作液(6)FPA(SIGMA)(7)羊抗人FPA抗体(8)辣根过氧化物酶标记的驴抗羊抗体(9)Superblock溶液。
1.2 方法
1.2.1 原理 其原理是标本与凝血酶作用释放出FPA抗原，加入过量的FPA抗体(一抗)，FPA与部分抗体结合。将抗原抗体复合物加入包被有FPA的酶标板，混合液中未被结合的第一抗体与酶标板上的FPA结合，再加入酶标记的第二抗体，最后加酶底物显色。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。
1.2.2 实验步骤 参考任跃明[2]等的方法进行，略有改动。稀释至10 μg/ml的FPA抗原包被96孔板，4℃过夜，包被体积100 μL/孔。洗甩5次后，加10%200 μL/孔 BSA 37 ℃封闭2 h。用10%的Superblock溶液将样品稀释10倍后，加入等体积的凝血酶混匀，37℃放置30 min。然后用10%Superblock溶液将复溶的FPA稀释为2.5 ng/ml，10 ng/ml,40 ng/ml，80 ng/ml,160 ng/ml。然后取稀释标准液、悬液、及10%Superblock溶液各75 μL，加入300 μL用生理盐水稀释750倍的羊抗人FPA，37℃水浴1 h。加100 μL/孔于酶标板，37℃孵育1 h。洗甩5次后，加酶标二抗(辣根过氧化物酶标记的驴抗羊抗体1﹕5000)100 μL/孔37℃孵育1 h。洗甩5次后，加底物TMB显色5 min(100 μL/孔)。最后每孔加50 μLH2SO4终止反应。492 nm酶标仪下读OD值。
1.3 结果判定 参考任跃明[2]等的方法进行，略有改动。将FPA含量、对INVA做双对数直线回归，求得回归方程，计算样品的FPA含量，r应大于等于0.9 9。
INV A=1一(A样品一A空白)/(A样品稀释液-A空白)
2 结果
2.1 第二抗体稀释倍数选择 生理盐水将第二抗体稀释至500倍、1000倍、1300倍，用竞争抑制性ELISA法测定，根据测得A值绘制曲线，结果显示稀释1000倍为适宜的第二抗体稀释倍数。
2.2 凝血酶稀释度选择 40 mmol/LCaCl2稀释凝血酶至2.5、5、10、20、40、80、100、150 IU/ml，ELISA测定，根据测得A值绘制曲线，结果表明10 IU/ml为最适宜凝血酶作用浓度。
2.3 反应温度、时间选择 选择FPA抗原-第一抗体混合液分别选择作用45 min、1.5 h，选择室温，20℃、37℃三种不同温度，ELISA棋盘法测定，同上绘制曲线，结果表明室温1.5 h为较理想的作用条件。
2.4 人血浆中纤维蛋白原含量回收率分析 样品稀释液将FPA标准品稀释至60 ng/ml，20 ng/ml，5 ng/ml，结果分别为64.3、19.6、5.5 ng/ml，回收率分别为107.2%、98%、110%。
3 讨论
人纤维蛋白原为我国新近研制的产品 ......
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