复方血栓通胶囊微生物限度检查法的验证
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【摘要】 目的 建立复方血栓通胶囊微生物限度检查方法。方法 采用《中国药典》(2010年版)一部微生物限度检查法对复方血栓通胶囊微生物限度检查进行验证。结果 复方血栓通胶囊对金黄色葡萄球菌,枯草芽孢杆菌有抑制作用,不适宜采用平皿法检查。因此选择用培养基稀释法消除其抑菌活性。结论 本品细菌数检查可用培养基稀释法；霉菌和酵母菌数可用常规法；大肠埃希菌检查可常规法进行检测。
【关键词】 复方血栓通胶囊；微生物限度；抑菌活性；培养基稀释法
复方血栓通胶囊是国家火炬计划重大项目的成果，是全国为数不多的单品种年销售数亿元的中成药。复方血栓通胶囊由三七、黄芪、丹参、玄参经科学方法提取有效成分制成；功效活血化瘀,益气养阴；用于血瘀兼气阴两虚证的视网膜静脉阻塞、稳定性劳累型心绞痛等。由于功效显著，应用广泛，被载入《中国药典》。复方血栓通胶囊为不含原药粉的口服制剂，微生物限度检查包括细菌、霉菌和酵母菌、控制菌中的大肠埃希菌。为了保证用药安全，确立可靠的微生物限度检验方法，作者按照《中国药典》 微生物限度检查方法[1] 规定，对该品的微生物限度的检查法进行了验证。现报告如下。
1 实验材料
1.1 仪器及样品 JYT-2架盘天平，LRH-150B型生化培养箱，隔水式电热恒温培养箱，MLS-3750高压蒸汽灭菌器，洁净工作台，三角瓶，培养皿等。
复方血栓通胶囊(广东众生药业股份有限公司100901 101001 101201)
1.2 培养基稀释剂及试剂 营养琼脂培养基和对照培养基,玫瑰红钠琼脂培养基和对照培养基,改良马丁培养基,营养肉汤培养基,胆盐乳糖培养基和和对照培养基，4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基和对照培养基,麦康凯琼脂培养基和对照培养基，pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液等,均来源于中国生物制品检定所。
1.3 试验用菌种 大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102],金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003],枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63501],白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]，以上菌种均来源于中国生物制品检定所,黑曲霉(Aspermlillus nimler)[CMCC(F)98003]菌种来源于广东省药品检验所。所有菌种均为不超5代的菌株。
2 方法和结果
2.1 细菌、霉菌及酵母菌检查法的验证
2.1.1 菌液的制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养18~24 h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，培养24~48 h。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成每1 ml含菌数约为50~100 cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5 d，加入5 ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 ml含孢子数50~100 cfu的孢子悬液，备用。
2.1.2 供试液的制备 取样品10 g，置已灭菌的三角瓶中,分别加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 ml,混合均匀,制成1∶10的样品稀释液。平皿法直接取稀释液为供试液。
2.1.3 培养基的适用性检查 按照《中国药典》(2010版)相关规定检查，培养基上的菌落平均数不小于对照的菌落平均数的70%，形态大小与对照的一致，判定培养基的适用性检查符合规定。
2.1.4 验证方法
2.1.4.1 平皿(常规)法
2.1.4.1.1 试验组 取供试液1 ml和50~100 cfu的试验菌各1 ml,分别注入平皿中 立即倾注相应琼脂培养基,每株试验菌平行制备2份，按平皿法测定其菌数。
2.1.4.1.2 试验菌液组 取已制备好含50~100 cfu的试验菌液各1 ml分别注入平皿中，加入大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的试验平皿立即倾注营养琼脂培养基，30~35℃培养3 d，计数；加入白色念珠菌、黑曲霉的试验平皿倾注玫瑰红钠琼脂培养基。23~28℃培养5 d，计数。每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。
2.1.4.1.3 供试品对照组 取供试液1 ml注入平皿中,立即倾注营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基15~20 ml, 每种培养基平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。
2.1.4.2 培养基稀释法
2.1.4.2.1 试验组 取供试液1 ml分别等量注入五个平皿中，并分别加入50~100 cfu的试验菌各1 ml,立即倾注相应琼脂培养基，每株试验菌平行制备2份，按培养基稀释法测定其菌数。
2.1.4.2.2 试验菌液组 取已制备好含50~100 cfu的试验菌液各1 ml分别注入平皿中，加入大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的试验平皿立即倾注营养琼脂培养基，30℃~35℃培养3 d，计数；加入白色念珠菌、黑曲霉的试验平皿倾注玫瑰红钠琼脂培养基。23℃~28℃培养5 d，计数。每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。
2.1.4.2.3 供试品对照组 取供试液1 ml分别等量注入五个平皿中,立即倾注营养琼脂培养基15~20 ml, 平行制备2份，按平皿法测定其菌数。
2.1.5 回收率计算
回收率(%)=试验组平均菌数-供试品对照组平均菌数试验菌液组平均菌数×100%
2.1.5.1 平皿法检测的结果 金黄色葡萄球菌,枯草芽孢杆菌试验组的回收率<70%,表明该产品对金黄色葡萄球菌,枯草芽孢杆菌有抑菌活性作用, 细菌检查不适宜采用平皿法，细菌检查应采用其他方法重新验证；其余试验组的回收率>70%，霉菌及酵母菌检查可采用平皿法。见表1。
2.1.5.2 培养基稀释法检测的结果 大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌, 枯草芽孢杆菌试验组的回收率均>70%，见表2。表明该产品的抑菌活性消除，细菌数检查可采用培养基稀释法。
2.2 大肠埃希菌(控制菌)检查法的验证
2.2.1 菌液制备 取大肠埃希菌斜面培养基少许,接种5 ml营养肉汤培养基内,置30~35℃培养24 h,取均匀培养物1 ml,用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成每1 ml含菌数约为10~100 cfu的菌悬液,在2~8℃保存,备用。
2.2.2 大肠埃希菌检查用培养基的适用性检查
按照《中国药典》(2010版)相关规定检查，培养基的促生长能力、抑制能力和指示能力均符合要求，判培养基的适用性检查符合规定
2.2.3 验证方法 试验组：取1:10供试液10 ml和上述含10~100 cfu大肠埃希菌液1 ml；阳性对照组：取含10~100 cfu大肠埃希菌液1 ml；阴性对照组：取0.9%无菌氯化钠溶液10 ml；分别加入盛有100 ml胆盐乳糖增菌液的三角瓶中 ......
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