血小板源性生长因子受体-β在蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛中的作用(2)
参见附件(12kb)。
1 资料与方法
1.1 动物及其分组 健康清洁的新西兰大白兔36只(上海生旺实验动物养殖有限公司提供) 许可证号SCXK(沪)2007-0007，质量2.0～2.8 kg，雌雄不限。其中制模导致死亡9只，重新补入实验动物9只后，随机分为2组：①对照组：6只。②SAH组：30只。SAH组根据注血后处死时间，随机分为注血后1、3、5、7、10 d，共5组，每组6只。
1.2 CVS模型的制备 采用枕大池二次注血法建立稳定的兔CVS模型。 以盐酸氯氨酮(30 mg/kg)和盐酸氯丙嗪(7.5 mg/kg)联合行肌内注射麻醉，侧卧位枕部常规消毒后，充分暴露寰枕关节间硬脊膜，用2 ml注射器针头行枕大池穿刺，缓慢释放脑脊液0.4 ml/kg，同时将未抗凝的等量兔自体耳中央动脉血，缓慢注入枕大池，术后保持头低位30 min。对照组用等量的37℃生理盐水代替动脉血，余处理同上。48 h重复上述操作，注入的动脉血量为0.2 ml/kg。二次注血后24 h为SAH后第1天，依次类推。
1.3 标本留取方法 将SAH组按照不同时间点、对照组于造模后第5天过量麻醉，充分暴露心脏和主动脉根部，夹闭下腔静脉和降主动脉，左心室穿入自制灌注针头，同时剪开右心房放血，用多聚甲醛溶液经心脏灌注固定后，开颅取含基底动脉的脑干，置入多聚甲醛固定24 h后，进行组织取材、石蜡包埋、组织切片(与血管横断面平行，层厚4 μm)。
1.4 基底动脉直径测量 每个标本分别切1张切片，行常规苏木精-伊红染色，并通过计算机图像分析系统(Image-pro plus5.1)，量化分析对照组和SAH各组基底动脉管腔直径变化。
1.5 透射电子显微镜观察 另取新西兰大白兔4只，将其随机分为2组：①对照组(NS组)：2只。②SAH组术后第7天：2只。制模及取材过程大致同上，灌注时采用的是预冷的2.5%戊二醛溶液。具体过程：3%戊二醛-1.5%多聚甲醛前固定，1%锇酸-1.5%亚铁氰化钾后固定，酒精-丙酮脱水，环氧树脂618包埋剂包埋；超薄切片，醋酸铀、柠檬酸铅染色，飞利浦208型透射电镜观察、摄影。
1.6 PDGFR-β表达的检测及结果判断 一抗：兔抗兔PDGFR-β多克隆抗体，SANTA CRUZ公司；二抗：PV9002，北京中杉金桥生物工程公司。一抗浓度按1:200稀释，并严格按照兔超敏二步法试剂盒说明进行免疫组化染色。PBS代替一抗作为阴性对照，乳腺癌组织作为阳性对照。采用Leica DM2500显微镜拍照系统(福建医科大学实验室提供)分别对各组标本基底动脉内皮细胞和平滑肌细胞的PDGFR-β的表达进行观察，免疫组化染色后细胞质中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，每个标本分别取3张切片进行免疫组化。
1.7 统计学方法 采用SPSS 11.5统计软件进行数据处理，各组基底动脉直径的均数采用单因素方差分析(One-way，AVONA，LSD检验)，PDGFR-β的表达情况采用Mann-Whitney U检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 基底动脉内径的变化 对照组基底动脉管腔呈圆形或椭圆形，在SAH组的各时间点内，基底动脉均发生了明显的痉挛，出现管腔直径的不同程度的缩小(P<0.01)，在术后第1天下降明显(P<0.01)，随后有所恢复，但与对照组相比，第3、5天仍有下降趋势，在第7天再次明显收缩(P<0.01)，第10天时管径狭窄程度比第7天有所缓解。SAH各组间比较，除第1天与第5天基底动脉直径无明显变化(P>0.05)，其余组间比较，直径变化比较差异有统计学意义(P<0.05)。
表1 各组的基底动脉的管腔直径(x±s，μm)
2.2 透射电镜结果 对照组：血管壁超微结构正常，内皮细胞线粒体结构正常，紧密连接呈纺锤形，弹力膜排列整齐，平滑肌细胞、外膜成纤维细胞结构正常。SAH组：血管部分内皮细胞脱落，胞浆空泡样变，紧密联接打开，内皮间隙扩大；内弹力膜扭曲、断裂；平滑肌细胞变形，排列紊乱，胞浆空泡化；外膜胶原水肿，成纤维细胞增多，可见大量中性粒细胞、单核细胞浸润。
图1-A 对照组：内皮细胞结构正常，紧密连接正常，平滑肌细胞排列规则(TEM 8000)
图1-B SAH组：内皮细胞脱落，紧密连接打开，内弹力膜扭曲、断裂，平滑肌细胞胞浆空泡化，外膜可见大量中性粒细胞、单核细胞浸润(TEM 8000)
2.3 PDGFR-β的表达情况 根据文献[3] ......
1 资料与方法
1.1 动物及其分组 健康清洁的新西兰大白兔36只(上海生旺实验动物养殖有限公司提供) 许可证号SCXK(沪)2007-0007，质量2.0～2.8 kg，雌雄不限。其中制模导致死亡9只，重新补入实验动物9只后，随机分为2组：①对照组：6只。②SAH组：30只。SAH组根据注血后处死时间，随机分为注血后1、3、5、7、10 d，共5组，每组6只。
1.2 CVS模型的制备 采用枕大池二次注血法建立稳定的兔CVS模型。 以盐酸氯氨酮(30 mg/kg)和盐酸氯丙嗪(7.5 mg/kg)联合行肌内注射麻醉，侧卧位枕部常规消毒后，充分暴露寰枕关节间硬脊膜，用2 ml注射器针头行枕大池穿刺，缓慢释放脑脊液0.4 ml/kg，同时将未抗凝的等量兔自体耳中央动脉血，缓慢注入枕大池，术后保持头低位30 min。对照组用等量的37℃生理盐水代替动脉血，余处理同上。48 h重复上述操作，注入的动脉血量为0.2 ml/kg。二次注血后24 h为SAH后第1天，依次类推。
1.3 标本留取方法 将SAH组按照不同时间点、对照组于造模后第5天过量麻醉，充分暴露心脏和主动脉根部，夹闭下腔静脉和降主动脉，左心室穿入自制灌注针头，同时剪开右心房放血，用多聚甲醛溶液经心脏灌注固定后，开颅取含基底动脉的脑干，置入多聚甲醛固定24 h后，进行组织取材、石蜡包埋、组织切片(与血管横断面平行，层厚4 μm)。
1.4 基底动脉直径测量 每个标本分别切1张切片，行常规苏木精-伊红染色，并通过计算机图像分析系统(Image-pro plus5.1)，量化分析对照组和SAH各组基底动脉管腔直径变化。
1.5 透射电子显微镜观察 另取新西兰大白兔4只，将其随机分为2组：①对照组(NS组)：2只。②SAH组术后第7天：2只。制模及取材过程大致同上，灌注时采用的是预冷的2.5%戊二醛溶液。具体过程：3%戊二醛-1.5%多聚甲醛前固定，1%锇酸-1.5%亚铁氰化钾后固定，酒精-丙酮脱水，环氧树脂618包埋剂包埋；超薄切片，醋酸铀、柠檬酸铅染色，飞利浦208型透射电镜观察、摄影。
1.6 PDGFR-β表达的检测及结果判断 一抗：兔抗兔PDGFR-β多克隆抗体，SANTA CRUZ公司；二抗：PV9002，北京中杉金桥生物工程公司。一抗浓度按1:200稀释，并严格按照兔超敏二步法试剂盒说明进行免疫组化染色。PBS代替一抗作为阴性对照，乳腺癌组织作为阳性对照。采用Leica DM2500显微镜拍照系统(福建医科大学实验室提供)分别对各组标本基底动脉内皮细胞和平滑肌细胞的PDGFR-β的表达进行观察，免疫组化染色后细胞质中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，每个标本分别取3张切片进行免疫组化。
1.7 统计学方法 采用SPSS 11.5统计软件进行数据处理，各组基底动脉直径的均数采用单因素方差分析(One-way，AVONA，LSD检验)，PDGFR-β的表达情况采用Mann-Whitney U检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 基底动脉内径的变化 对照组基底动脉管腔呈圆形或椭圆形，在SAH组的各时间点内，基底动脉均发生了明显的痉挛，出现管腔直径的不同程度的缩小(P<0.01)，在术后第1天下降明显(P<0.01)，随后有所恢复，但与对照组相比，第3、5天仍有下降趋势，在第7天再次明显收缩(P<0.01)，第10天时管径狭窄程度比第7天有所缓解。SAH各组间比较，除第1天与第5天基底动脉直径无明显变化(P>0.05)，其余组间比较，直径变化比较差异有统计学意义(P<0.05)。
表1 各组的基底动脉的管腔直径(x±s，μm)
2.2 透射电镜结果 对照组：血管壁超微结构正常，内皮细胞线粒体结构正常，紧密连接呈纺锤形，弹力膜排列整齐，平滑肌细胞、外膜成纤维细胞结构正常。SAH组：血管部分内皮细胞脱落，胞浆空泡样变，紧密联接打开，内皮间隙扩大；内弹力膜扭曲、断裂；平滑肌细胞变形，排列紊乱，胞浆空泡化；外膜胶原水肿，成纤维细胞增多，可见大量中性粒细胞、单核细胞浸润。
图1-A 对照组：内皮细胞结构正常，紧密连接正常，平滑肌细胞排列规则(TEM 8000)
图1-B SAH组：内皮细胞脱落，紧密连接打开，内弹力膜扭曲、断裂，平滑肌细胞胞浆空泡化，外膜可见大量中性粒细胞、单核细胞浸润(TEM 8000)
2.3 PDGFR-β的表达情况 根据文献[3] ......
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