实时荧光定量PCR技术研究进展及应用
作者单位：473058河南省南阳医学高等专科学校第一附属医院检验科1 研究进展
二十多年前，美国Perkin-Elmer Cetus公司人类遗传研究室Mullis等发明了聚合酶链反应(PCR)技术，这成为20世纪生物医学领域革命性创举与里程碑，使人们梦寐以求的体外无限扩增核酸片段的愿望成为现实。几年后，世界生物实验室中，PCR技术占据了统治地位，并成为分子生物领域的关键技术。大量特异性PCR产物的生成使许多新的DNA分析方法的使用成为可能，这些分析方法包括下游修饰或互补性产物分析技术。但是，利用传统的PCR技术进行检测鉴定时，需要将扩增反应后的电泳进行分离及染色处理，且不能准确定量，使其应用受到限制。1992年，Higuchi最早提出了实时PCR的设想，它的基本思想是利用荧光染料EB(溴化乙锭)可以插入到双链核酸中受激发光的性质，在PCR反应的退火或延伸时检测掺入到双链核酸中EB的含量就能实时监控PCR反应的进程，根据PCR反应的数学函数关系，结合相应的算法，通过加入标准品的方法，就可以对待测样品中的目标基因进行准确定量。但Higuchi利用的是嵌入荧光染料检测，它只能简单地反映PCR反应体系中总的核酸量，是一种非特异性的检测方法。直到1995年，美国PE公司研制成功具有革命性意义的荧光定量PCR技术，融合了PCR高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确定量等优点，直接探测PCR过程中荧光信号的变化，以获得特定区段扩增产物定量的结果，不需要PCR后处理或电泳检测，完全闭管操作，克服了常规PCR技术的诸多难题。1996年美国Applied Biosystems公司推出了成熟的实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction.FQ-PCR)技术。实时荧光定量PCR技术的出现，标志着DNA分析领域的又一次革命性飞跃。这种先进技术，是在原PCR方法基础上的又一次进展，使高效的DNA定量、定性分析，以及高灵敏性DNA扩增成为可能 ......
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