骨髓间充质干细胞对退变椎间盘细胞因子的影响(1)
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【摘要】 目的 探讨兔骨髓间充质干细胞(bone mesenchvmal stem cells，BMSCs)移植到兔退变椎间盘后，观察退变椎间盘中相关细胞因子的变化。方法 采用体外细胞培养技术，将兔BMSCs自骨髓血中分离、纯化和培养，成功传代到P3代后植入兔退变椎间盘的模型中，分别于2、4、8、12周用荧光定量PCR法测定MMP，1、IL，1的变化，所得数据经SPSS 13统计学软件进行统计学处理。结果 在实验组MMP，1、IL，1的含量随着治疗时间的延长，其含量逐渐降低，与正常组，空白组，干预组在统计学显示差异有统计学意义(P<0.05)。结论 BMSCs移植到退变椎间盘后可以在一定程度上抑制MMP，1、IL，1表达，从而延缓椎间盘退变。
【关键词】骨髓间充质干细胞；椎间盘；细胞因子
腰腿痛是骨科临床常见的疾患，绝大多数与椎间盘退变有关。目前，腰腿痛的临床治疗都只能缓解疼痛等症状，而不能阻止、逆转椎间盘退变的发生。随着对退变椎间盘病理生理认识的深入，及组织工程和细胞治疗学的兴起，利用BMSCs治疗退变椎间盘已成为可能。BMSCs是一群存在于骨髓中的非造血干细胞，其作为组织工程的种子细胞在来源，分化潜能，免疫学等方面具有诸多优势。本研究旨在观察退变椎间盘中细胞因子白介素1(interleukin，1，IL，1)、基质金属蛋白酶1(matrix met alloproteinases，MMP，1)在经BMSCs移植治疗退变椎间盘后的变化规律，为BMSCs在椎间盘组织工程的应用中提供参考。
1 材料和方法
1.1 LG，DMEM 培养基(Gibeco公司，美国)、100% 胎牛血清(杭州四季青公司)、胰蛋白酶、Perco ll比重1.077 g /L、台盼兰试剂(美国Sigma公司)、戊巴比妥钠(美国Sigma公司)、TrizolRNA提取试剂盒、MMLV逆转录酶、Taq聚合酶、dNTP 、SABC免疫组化试剂盒(美国Invitrogen公司)、1.5 T磁共振仪(西门子公司)、倒置荧光相差显微镜、5% CO2细胞培养箱(Heraeus公司，德国)、全自动脱水机、全自动石蜡包埋机、一次性培养瓶、培养板、离心管(Corning公司)，动物解剖器械及16 g穿刺针(本院提供)。新西兰大白兔由东南大学医学院动物中心提供。共36只，体重2.5~3.5 kg。
1.2 方法
1.2.1 干细胞分离培养、鉴定
取2月龄新西兰大白兔4只，雌雄不拘，3 g/L戊巴比妥钠(1.0 mg/kg)耳缘静脉麻醉，于髂后上嵴处备皮，消毒，铺巾，并2 g/L利多卡因穿刺部位局部麻醉。21号骨髓穿刺针接10 ml注射器(内含3000 KU/L肝素钠1.0 ml)，穿刺入骨髓腔，抽取5.0 ml骨髓。按文献[1]中细胞分离培养及传代方法进行。选用生长状况良好的第3代MSCs，传代培养于6孔板中行爬片，采用免疫化学ABC 法检测CD34、CD44、CD90 等抗原表达，并留取第3代BMSCs。
1.2.2 退变椎间盘模型的建立
新西兰大白兔32只，1岁龄，2.5~3.5 kg，雌雄各半。麻醉方法同干细胞的提取。取右侧卧位，根据髂嵴定位(平腰6椎体常规备皮、消毒、铺巾。采用腰椎左侧前方倒“八”字人路，暴露脊柱的左前外侧。用21 g皮肤穿刺针头分别在L3~4、L4~5及L5~6椎间盘(兔的腰椎数为7节)进行穿刺。持针器夹持针头，尖端保留5 mm长度，于纤维环前外侧方平行终扳方向刺入，深度控制在5 mm，刺入后维持5 s，拔出穿刺针，遂层缝合创口，其中8只行手术但不行穿刺纤维环，作为正常组。术后将24只造模大白兔随机分空白组，干预组，实验组，每组8只，分笼饲养，术后3 d用庆大霉素肌肉注射。在第2周各组随机抽取2只行MRI。
1.2.3 骨髓间充质干细胞的移植
造模成功后，实验组L3~4、L4~5、L5~6节段将用藻酸盐凝胶作为支架的BMSCs移植，干预组仅用藻酸盐凝胶干预，实验组和干预组分别按造模手术入路及方法移植BMSCs，空白组施行上述手术，但不行任何移植，正常组不施加任何处理。
1.3 标本的处理及指标的检测
1.3.1 标本的处理
移植术后分别在2、4、8、12周取材，每次每组各取2只，采用空气栓塞法处死动物。取各组实验大白兔L3~4、L4~5、L5~6阶段椎间盘，并用灭菌生理盐水清洗后液氮(，70℃)保存待用。
1.3.2 荧光定量PCR反应检测IL，1、MMP，1的表达
采用标准Trizol一步法提取各标本中的椎间盘髓核细胞的总RNA，获得的RNA溶解保存于，80℃待用。取各样本1 μg稀释至500 μg，紫外吸收法测量RNA的含量和纯度(260和280 nm处吸收值，RNA溶液的A260/A280的比值为RNA浓度，比值范围1.8~2.1)。取2 μg 总RNA用逆转录酶MMLV进行样品cDNA合成，将逆转录产物cDNA 模板1 μl分别加入到总体积为50 μl的含有各种反应物的反应体系中，混合，离心，置于PCR仪内扩增。同时取等量cDNA 扩增β，actin 作为内参。PCR反应条件(共40个PCR循环数)：93℃ 2 min 预变性；然后93℃ 1 min、55℃ 1 min、72℃ 1 min；最后总延伸72 ℃ 7 min。PCR产物与DNALadder在2%琼脂糖凝胶进行电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。紫外光凝胶成像系统扫描PCR产物条带灰度，以目的基因与β，actin 内参的灰度比值进行定量分。IL，1引物序列：上游引物5 GCCACAAAGCCAGAACAT 3，下游引物5 TAACAGCGGAAGGCAAAT 3,扩增长度为495 bp；MMP，1引物序列：上游引物 5 ATGAAGTTGCCCATAGAG 3 ......
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