UrotensinⅡ对大鼠心脏效应的作用机制探讨(1)
【摘要】 目的 探讨UⅡ(Urotensin Ⅱ)作用于大鼠心脏效应的电生理机制及可能的信号转导通路。方法 利用全细胞膜片钳技术，给予不同浓度的 UⅡ、KT5720+UⅡ及KT5720 对照组后，观察大鼠心功能及心肌细胞L型钙电流密度的变化。结果 ①运用全细胞膜片钳技术，在单个心肌细胞上给予不同浓度的UⅡ(109～105mol/L)灌流，IcaL峰值分别下降为(670±178)pA/pF、(593±202)pA/pF、(540±215)pA/pF、(454±200)pA/pF、(380±182)pA/pF，与对照组(803±120)pA/pF相比，差异有统计学意义(P<005)。②在灌流KT5720的基础上给予UⅡ(IC50)，IcaL峰值二者比较变化不明显。结论 UⅡ呈浓度依赖性的抑制大鼠心肌细胞L型钙电流强度，KT5720可阻断UⅡ对大鼠心肌细胞钙电流的抑制作用，UⅡ可能通过PKA途径抑制心肌细胞L型钙电流而发挥其心功能抑制作用。
【关键词】 UrotensinⅡ；心肌细胞；L型钙电流 基金课题：2009年山西省留学归国人员科技活动项目(项目编号：201097)；山西省回国留学人员科研资助项目(项目编号：20099)；2009年山西医科大学科技创新基金项目(项目编号：20107)
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作者单位：030001 太原，山西医科大学第一医院 Urotensin Ⅱ(尾加压素Ⅱ，UⅡ)是最初从硬骨鱼尾部的下垂体中被提取出的一种生长抑素样多肽[1]，主要分布于心血管及神经系统[2，3]，它的缩血管效应是内皮素的8~10倍[4]。Ames等[5]的研究发现，人体内的孤儿受体G蛋白偶联受体14(Gprotein coupled receptor 14,GPR14，UT)是UⅡ的特异性受体。UⅡ与UT结合后，可产生多种生物学效应，如促进内皮细胞、血管平滑肌细胞、心肌纤维细胞的增殖、强烈的收缩血管作用及心脏抑制等心血管效应。其作用途径很多，可能有钙(Ca2+)、磷脂酶、酪氨酸激酶、RhoA等因子参与[6]，但具体通过哪条信号转导通路发挥效应尚不清楚。本研究利用全细胞膜片钳技术，观察UⅡ对大鼠心肌细胞L型钙电流的影响，并选用特异性PKA拮抗剂KT5720，研究KT5720对UⅡ作用的阻断效应，进而阐明UⅡ作用于大鼠心脏效应的可能电生理机制及信号转导通路。1 材料与方法11 材料 Wistar大鼠，♂，体重200~250 g，由山西医科大学实验动物中心提供。主要试剂：Urotensin Ⅱ(human)与KT5720购自英国TOCRIS公司；牛磺酸(taurine)、L谷氨酸(Lglutamic acid)、乙二醇四乙酸(EGTA)、HEPES(hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid)均购自美国Sigma公司；胶原酶P(Collagenase P)购自德国Bochringer Mannhein公司；其余试剂均为国产分析纯试剂。12 单个心室肌细胞的急性分离 取大鼠击头致昏，迅速剪断颈部放血, 开胸取出心肺, 立即置于0℃氧饱和的无钙台式液中修剪, 然后将心脏挂在Langendorff 灌流装置上经主动脉逆行灌流，流速2 ml/min。先用无钙台式液灌流7～8 min，再用酶液循环灌流15～20 min。灌流过程中保持37℃恒温，灌流压为70 cmH2O，并持续通以100%氧气。待心脏组织变大、变软后将左心室肌组织剪下来，置于KB液中轻柔吹打，得到分散的心室肌细胞，经150 μm孔径的滤网过滤后保存于KB液中，室温下稳定1 h后，放入4℃冰箱静置2 h备用。13 全细胞膜片钳记录 实验前先将存放于KB液中的心室肌细胞复钙，复钙终浓度为18 mmol/L。吸取适量细胞悬液滴加于灌流槽中,放置5～10 min 使细胞牢固贴壁后,用细胞外灌流液以1～2 ml/min 匀速灌流,使细胞逐渐复钙,10～20 min 后,于倒置相差显微镜下选择贴壁牢固、无跳动、横纹清晰、折光性好、立体感强的细胞进行实验。玻璃微电极由PP83型二步拉制仪(Narishige Co，Japan)拉制而成,充灌电极内液后，电极电阻为2～5 mΩ。用微电极操纵器(Narishige Co，Japan)将电极推向细胞,负压吸引形成高阻封接,电击破细胞膜,补偿电容电流和串联电阻,形成全细胞记录模式记录ICa L。细胞破膜后5 min 开始记录IcaL，电流值以电流密度(pA/ pF)表示。以上记录均在室温下进行。信号经Axopatch200B膜片钳放大器放大、Digidate 1322A模数转换器转换，通过pClamp82软件进行数据采集、储存及分析。
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L型钙电流记录：在全细胞模式下，用TEACl、CsCl阻断电压依赖性的Ik，从钳制电位40 mV开始，以10 mV步阶逐步去极化至+50 mV，电压刺激时程为300 ms，刺激频率为01 Hz激活IcaL。心肌细胞分离及全细胞电流记录方法参照文献。14 溶液组成 台氏液(mmol/L): KCl 54；NaH2PO4033；HEPES 50；Glucose 100；MgCl2 10；NaCl 140；CaCl218； 用NaOH 调pH 值到735～740。无钙台氏液: 去除钙离子的台式液。酶液(mmol/L): KCl54；NaH2PO4 033；HEPES 50；Glucose 100；MgCl2 10；NaCl 125；Taurine 200；CaCl2 75 μmol/L；胶原酶P 5～7 mg。KB液(mmol/L):L谷氨酸500；KCl 300；牛磺酸200；KH2PO4 300；HEPES 100；Glucose 100；MgCl2 10；EGTA 05； 用KOH调pH 值到735～740。
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L型钙电流(IcaL)的电极内液(mmol/L)：KCl 150；HEPES 50；EGTA 50；K2ATP 30；MgCl2 10；4AP 50；MgATP 10,；用KOH调pH 值到73。细胞外灌流液为台式液。15 统计学处理 原始数据经Clampfit处理。实验数据以均数±标准差(x±s)表示。两样本均数间比较用t检验，多个样本均数间比较用方差分析。P<005认为差异有统计学意义。2 结果21 UⅡ对大鼠心肌细胞IcaL的影响211 不同浓度的UⅡ对大鼠心肌细胞IcaL的影响 109～105mol/L UⅡ灌流5 min后，UⅡ呈浓度依赖性的抑制大鼠心肌细胞IcaL，106和105 mol/L UⅡ的下降率明显大于对照组(P<001，n=10)(图1)。
图1 109～105mol/L UⅡ灌流后，UⅡ呈浓度依赖性的抑制大鼠心肌细胞IcaL212 不同浓度UⅡ对大鼠心肌细胞L型钙电流密度的影响(表1，图2), http://www.100md.com(韩清华 刘文媛 李晨娟 王睿 史宏涛)
【关键词】 UrotensinⅡ；心肌细胞；L型钙电流 基金课题：2009年山西省留学归国人员科技活动项目(项目编号：201097)；山西省回国留学人员科研资助项目(项目编号：20099)；2009年山西医科大学科技创新基金项目(项目编号：20107)
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作者单位：030001 太原，山西医科大学第一医院 Urotensin Ⅱ(尾加压素Ⅱ，UⅡ)是最初从硬骨鱼尾部的下垂体中被提取出的一种生长抑素样多肽[1]，主要分布于心血管及神经系统[2，3]，它的缩血管效应是内皮素的8~10倍[4]。Ames等[5]的研究发现，人体内的孤儿受体G蛋白偶联受体14(Gprotein coupled receptor 14,GPR14，UT)是UⅡ的特异性受体。UⅡ与UT结合后，可产生多种生物学效应，如促进内皮细胞、血管平滑肌细胞、心肌纤维细胞的增殖、强烈的收缩血管作用及心脏抑制等心血管效应。其作用途径很多，可能有钙(Ca2+)、磷脂酶、酪氨酸激酶、RhoA等因子参与[6]，但具体通过哪条信号转导通路发挥效应尚不清楚。本研究利用全细胞膜片钳技术，观察UⅡ对大鼠心肌细胞L型钙电流的影响，并选用特异性PKA拮抗剂KT5720，研究KT5720对UⅡ作用的阻断效应，进而阐明UⅡ作用于大鼠心脏效应的可能电生理机制及信号转导通路。1 材料与方法11 材料 Wistar大鼠，♂，体重200~250 g，由山西医科大学实验动物中心提供。主要试剂：Urotensin Ⅱ(human)与KT5720购自英国TOCRIS公司；牛磺酸(taurine)、L谷氨酸(Lglutamic acid)、乙二醇四乙酸(EGTA)、HEPES(hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid)均购自美国Sigma公司；胶原酶P(Collagenase P)购自德国Bochringer Mannhein公司；其余试剂均为国产分析纯试剂。12 单个心室肌细胞的急性分离 取大鼠击头致昏，迅速剪断颈部放血, 开胸取出心肺, 立即置于0℃氧饱和的无钙台式液中修剪, 然后将心脏挂在Langendorff 灌流装置上经主动脉逆行灌流，流速2 ml/min。先用无钙台式液灌流7～8 min，再用酶液循环灌流15～20 min。灌流过程中保持37℃恒温，灌流压为70 cmH2O，并持续通以100%氧气。待心脏组织变大、变软后将左心室肌组织剪下来，置于KB液中轻柔吹打，得到分散的心室肌细胞，经150 μm孔径的滤网过滤后保存于KB液中，室温下稳定1 h后，放入4℃冰箱静置2 h备用。13 全细胞膜片钳记录 实验前先将存放于KB液中的心室肌细胞复钙，复钙终浓度为18 mmol/L。吸取适量细胞悬液滴加于灌流槽中,放置5～10 min 使细胞牢固贴壁后,用细胞外灌流液以1～2 ml/min 匀速灌流,使细胞逐渐复钙,10～20 min 后,于倒置相差显微镜下选择贴壁牢固、无跳动、横纹清晰、折光性好、立体感强的细胞进行实验。玻璃微电极由PP83型二步拉制仪(Narishige Co，Japan)拉制而成,充灌电极内液后，电极电阻为2～5 mΩ。用微电极操纵器(Narishige Co，Japan)将电极推向细胞,负压吸引形成高阻封接,电击破细胞膜,补偿电容电流和串联电阻,形成全细胞记录模式记录ICa L。细胞破膜后5 min 开始记录IcaL，电流值以电流密度(pA/ pF)表示。以上记录均在室温下进行。信号经Axopatch200B膜片钳放大器放大、Digidate 1322A模数转换器转换，通过pClamp82软件进行数据采集、储存及分析。
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L型钙电流记录：在全细胞模式下，用TEACl、CsCl阻断电压依赖性的Ik，从钳制电位40 mV开始，以10 mV步阶逐步去极化至+50 mV，电压刺激时程为300 ms，刺激频率为01 Hz激活IcaL。心肌细胞分离及全细胞电流记录方法参照文献。14 溶液组成 台氏液(mmol/L): KCl 54；NaH2PO4033；HEPES 50；Glucose 100；MgCl2 10；NaCl 140；CaCl218； 用NaOH 调pH 值到735～740。无钙台氏液: 去除钙离子的台式液。酶液(mmol/L): KCl54；NaH2PO4 033；HEPES 50；Glucose 100；MgCl2 10；NaCl 125；Taurine 200；CaCl2 75 μmol/L；胶原酶P 5～7 mg。KB液(mmol/L):L谷氨酸500；KCl 300；牛磺酸200；KH2PO4 300；HEPES 100；Glucose 100；MgCl2 10；EGTA 05； 用KOH调pH 值到735～740。
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L型钙电流(IcaL)的电极内液(mmol/L)：KCl 150；HEPES 50；EGTA 50；K2ATP 30；MgCl2 10；4AP 50；MgATP 10,；用KOH调pH 值到73。细胞外灌流液为台式液。15 统计学处理 原始数据经Clampfit处理。实验数据以均数±标准差(x±s)表示。两样本均数间比较用t检验，多个样本均数间比较用方差分析。P<005认为差异有统计学意义。2 结果21 UⅡ对大鼠心肌细胞IcaL的影响211 不同浓度的UⅡ对大鼠心肌细胞IcaL的影响 109～105mol/L UⅡ灌流5 min后，UⅡ呈浓度依赖性的抑制大鼠心肌细胞IcaL，106和105 mol/L UⅡ的下降率明显大于对照组(P<001，n=10)(图1)。
图1 109～105mol/L UⅡ灌流后，UⅡ呈浓度依赖性的抑制大鼠心肌细胞IcaL212 不同浓度UⅡ对大鼠心肌细胞L型钙电流密度的影响(表1，图2), http://www.100md.com(韩清华 刘文媛 李晨娟 王睿 史宏涛)