人工免疫组化的注意事项及影响因素
【关键词】 免疫组化；质量控制；抗原修复；原因分析
作者单位：262229 山东省诸城市人民医院病理科(李建国)，泌尿外科(陈善红) 免疫组织化学(IHC)是在1941年由微生物学家AH Coons起步的，在1976年Melistain及Kohler发明单克隆抗体技术以来得到了极大的发展。我国自1980年在国内逐步开展以来，至今已普遍应用于各级医院的病理诊断中，不仅在部分疑难病例的诊断与鉴别诊断中起着决定性的作用，而且对临床的介入越发深入，在肿瘤的预后判断、临床处理、治疗反应尤其是靶向治疗方面发挥着不可替代的重大作用。我院自上世纪九十年代开展人工免疫组化技术以来，至今已完成3000余例。现将我院在人工免疫组化工作当中的心得体会与大家做一探讨。
1 免疫组化实验原理与过程
免疫组化继承了组织化学用颜色代表化学成分的传统，全过程包括：首先从已知组织细胞中提取出抗原，然后通过免疫动物获得特异性抗体，继而把纯化的抗体标记上示踪剂(可用荧光剂或过氧化物酶)，最后一步则是把标记的抗体与欲检测的组织反应(染色)。免疫组化反应的位置抗原在细胞膜、细胞浆、细胞核甚至是在某一个细胞器上，有明确的定位，因而假如组织细胞某个部位出现抗体所带的染色，那就表明该处是抗体所在部位，也就是抗原所在的位置，从而证明所检测的组织细胞中有相关的化学成分，因而可以定性检测细胞内各种微生物、蛋白、多糖、核酸甚至DNA、RNA基因表达产物，在一定程度上可以说明组织细胞的代谢途径和功能作用。因而免疫组化是以形态学为主，形态、代谢、功能相结合的三位一体的科学[1]。
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1.1 组织的处理 免疫组化反应抗原的准确显示与定位制备的组织细胞标本质量的好坏密切相关。组织固定应及时充分，及时的固定不仅可使细胞内蛋白凝固，终止外/内源性酶活性，并可最大限度地保存组织细胞的形态结构和抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。大块组织应及时平行多刀剖开固定，时间以12~24 h为宜，固定剂首选10%中性福尔马林，组织块应选取新鲜无出血坏死并有代表性者，不宜过大过厚，必须小于2 cm×1.5 cm×0.3 cm，厚度≤0.3 cm，微小组织和液体沉淀物先用滤纸妥为包裹后固定。固定液体积一般大于组织20倍以上。
1.2 防脱玻片的处理 以前应用普通载玻片清洗后涂以多聚L赖氨酸防脱剂自己制作防脱片，现在国内病理科内已普遍应用免疫组化专用的商业防脱黏胶载玻片，质量稳定，开盒即用，已无需再处理。
1.3 包埋与切片 过热的石蜡液包埋容易破坏溃疡，宜选用低熔点的石蜡(熔点<60℃)。切片厚度需在3~5 μm，宜薄不宜厚，过厚的切片不仅影响免疫反应，而且影响镜下观察。
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1.4 抗原修复(AR) 组织细胞经福尔马林固定后，抗原结构的理化性质发生显著改变，表位空间结构改变导致许多抗原活性消失。通过一定的方法可以使组织抗原表位再次充分暴露，重现抗原的原有活性。目前，加热修复抗原是绝大多数抗原最有效的修复方法，但少数抗原需采用酶消化法。加热修复方法主要包括：高压法、微波法、水溶法等，实验显示修复效果为高压法>水溶法>微波法。需注意的是没有一种抗原修复液能适用于所有的抗体，因此需根据抗体选用合适的抗原修复液。
1.5 内源性生物素的封闭 在免疫组化中若采用过氧化物酶检测系统，必须灭活过氧化物酶，否则组织中的红细胞、粒细胞可能会干扰染色结果的判断。一般采用3%H2O2封闭效果比较显著，有时也在加一抗之前实验封闭血清，选择的血清种属一般与二抗的种属相同，以减少非特异性显色。一抗中若含有正常血清可免去此步骤。
1.6 冲洗 用于除去组织中的AR液、未被特异性结合的一抗和二抗并调节组织细胞的pH环境。要求在操作中应严格遵守实验冲洗步骤，动作轻缓，水流不得直对组织以防止脱片；冲洗次数与时间应足够。
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1.7 滴加试剂及孵育事项 包括滴加一抗、二抗与显色剂。轻轻倾去液，用滤纸吸干组织周围液体，轻轻蘸取组织表面水分(但绝对不能擦)；滴加试剂量要适中，把火柴杆尾端压片并展开，用之将试剂轻轻摊开至组织外1~2 mm，液面厚1 mm左右，注意操作过程中不能碰到组织，若有气泡可直接刺破或点走以免出现气泡下假阴性反应。抗体孵育的温度以25℃±8℃为准，时间约为30~60 min,。抗体孵育应在潮湿封闭的环境中进行，避免抗体试剂水分蒸发造成抗体浓缩干燥致使全片着色，因此高质量的孵育盒是免疫组化的必要实验用品。需要注意的是试剂的浓度、孵育温度和孵育时间是相互关联的，浓度与温度和时间基本成反比，即孵育浓度越高，孵育温度就应该越低，孵育时间就应该越短，反之亦然。试剂英避免长时间置于室温中，尽量减少溶冻次数，防止效价下降。
1.8 显色 DAB(棕色)显色剂应现配现用，30 min内用完。若切片量大时英分次配制分批显色。显色时间3~5 min，可根据温度和切片整体显色情况决定显色时间。一般显色时间过长会出现显色过深或背景着色，时间过短则会出现显色过浅或假阴性；尤其对部分需要定量报告的抗体如Ki67、PR、ER、Her2等更需细心观察，逐一适时终止反应。
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2 影响免疫组化染色的常见因素
2.1 组织损伤 如机械损伤、电烙手术损伤、组织变干，无论是组织固定欠佳还是染色过程中试剂覆盖组织欠佳，皆会导致组织变干后蛋白变性，抗原性丧失，表现为无色片或全片着色。
2.2 组织固定不理想 组织固定的好坏直接与抗原的保存有关，组织固定不及时，固定液的种类和浓度不恰当，固定时间过短过长皆会影响染色效果。
2.3 组织处理不当 在组织脱水、浸蜡、包埋、烤片过程中时间过长会导致抗原丢失。掌握的原则是：在石蜡能够熔化的前提下，温度越低抗原保存越好，而烤片温度常规在60℃，时间为1 h。
2.4 抗原修复不足 目前免疫组化染色结果不佳的主要原因是抗原修复不足。目前常用的高压锅法，应在喷气后再维持1.5~2 min。
2.5 抗体试剂质量问题 目前各公司生产的抗体一般都能保证产品质量，但由于运输、分装、储存等环节皆会影响产品质量，因此买回抗体后应进行测试确认不存在质量问题。
2.6 染色技术问题 免疫组化染色步骤繁多，任何一步出问题都会导致染色失败，而且染色效果与室温密切相关，因此操作者不仅应具有很强的责任心，而且在实际工作中应根据各实验室具体情况摸索出一套适合自己的工作规程。
参 考 文 献
[1] 周会芹，杨江辉，余琦，等.不同组织固定液对免疫组化结果的影响.诊断病理学杂志，2009,16(6)：478., http://www.100md.com(李建国 陈善红)
作者单位：262229 山东省诸城市人民医院病理科(李建国)，泌尿外科(陈善红) 免疫组织化学(IHC)是在1941年由微生物学家AH Coons起步的，在1976年Melistain及Kohler发明单克隆抗体技术以来得到了极大的发展。我国自1980年在国内逐步开展以来，至今已普遍应用于各级医院的病理诊断中，不仅在部分疑难病例的诊断与鉴别诊断中起着决定性的作用，而且对临床的介入越发深入，在肿瘤的预后判断、临床处理、治疗反应尤其是靶向治疗方面发挥着不可替代的重大作用。我院自上世纪九十年代开展人工免疫组化技术以来，至今已完成3000余例。现将我院在人工免疫组化工作当中的心得体会与大家做一探讨。
1 免疫组化实验原理与过程
免疫组化继承了组织化学用颜色代表化学成分的传统，全过程包括：首先从已知组织细胞中提取出抗原，然后通过免疫动物获得特异性抗体，继而把纯化的抗体标记上示踪剂(可用荧光剂或过氧化物酶)，最后一步则是把标记的抗体与欲检测的组织反应(染色)。免疫组化反应的位置抗原在细胞膜、细胞浆、细胞核甚至是在某一个细胞器上，有明确的定位，因而假如组织细胞某个部位出现抗体所带的染色，那就表明该处是抗体所在部位，也就是抗原所在的位置，从而证明所检测的组织细胞中有相关的化学成分，因而可以定性检测细胞内各种微生物、蛋白、多糖、核酸甚至DNA、RNA基因表达产物，在一定程度上可以说明组织细胞的代谢途径和功能作用。因而免疫组化是以形态学为主，形态、代谢、功能相结合的三位一体的科学[1]。
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1.1 组织的处理 免疫组化反应抗原的准确显示与定位制备的组织细胞标本质量的好坏密切相关。组织固定应及时充分，及时的固定不仅可使细胞内蛋白凝固，终止外/内源性酶活性，并可最大限度地保存组织细胞的形态结构和抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。大块组织应及时平行多刀剖开固定，时间以12~24 h为宜，固定剂首选10%中性福尔马林，组织块应选取新鲜无出血坏死并有代表性者，不宜过大过厚，必须小于2 cm×1.5 cm×0.3 cm，厚度≤0.3 cm，微小组织和液体沉淀物先用滤纸妥为包裹后固定。固定液体积一般大于组织20倍以上。
1.2 防脱玻片的处理 以前应用普通载玻片清洗后涂以多聚L赖氨酸防脱剂自己制作防脱片，现在国内病理科内已普遍应用免疫组化专用的商业防脱黏胶载玻片，质量稳定，开盒即用，已无需再处理。
1.3 包埋与切片 过热的石蜡液包埋容易破坏溃疡，宜选用低熔点的石蜡(熔点<60℃)。切片厚度需在3~5 μm，宜薄不宜厚，过厚的切片不仅影响免疫反应，而且影响镜下观察。
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1.4 抗原修复(AR) 组织细胞经福尔马林固定后，抗原结构的理化性质发生显著改变，表位空间结构改变导致许多抗原活性消失。通过一定的方法可以使组织抗原表位再次充分暴露，重现抗原的原有活性。目前，加热修复抗原是绝大多数抗原最有效的修复方法，但少数抗原需采用酶消化法。加热修复方法主要包括：高压法、微波法、水溶法等，实验显示修复效果为高压法>水溶法>微波法。需注意的是没有一种抗原修复液能适用于所有的抗体，因此需根据抗体选用合适的抗原修复液。
1.5 内源性生物素的封闭 在免疫组化中若采用过氧化物酶检测系统，必须灭活过氧化物酶，否则组织中的红细胞、粒细胞可能会干扰染色结果的判断。一般采用3%H2O2封闭效果比较显著，有时也在加一抗之前实验封闭血清，选择的血清种属一般与二抗的种属相同，以减少非特异性显色。一抗中若含有正常血清可免去此步骤。
1.6 冲洗 用于除去组织中的AR液、未被特异性结合的一抗和二抗并调节组织细胞的pH环境。要求在操作中应严格遵守实验冲洗步骤，动作轻缓，水流不得直对组织以防止脱片；冲洗次数与时间应足够。
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1.7 滴加试剂及孵育事项 包括滴加一抗、二抗与显色剂。轻轻倾去液，用滤纸吸干组织周围液体，轻轻蘸取组织表面水分(但绝对不能擦)；滴加试剂量要适中，把火柴杆尾端压片并展开，用之将试剂轻轻摊开至组织外1~2 mm，液面厚1 mm左右，注意操作过程中不能碰到组织，若有气泡可直接刺破或点走以免出现气泡下假阴性反应。抗体孵育的温度以25℃±8℃为准，时间约为30~60 min,。抗体孵育应在潮湿封闭的环境中进行，避免抗体试剂水分蒸发造成抗体浓缩干燥致使全片着色，因此高质量的孵育盒是免疫组化的必要实验用品。需要注意的是试剂的浓度、孵育温度和孵育时间是相互关联的，浓度与温度和时间基本成反比，即孵育浓度越高，孵育温度就应该越低，孵育时间就应该越短，反之亦然。试剂英避免长时间置于室温中，尽量减少溶冻次数，防止效价下降。
1.8 显色 DAB(棕色)显色剂应现配现用，30 min内用完。若切片量大时英分次配制分批显色。显色时间3~5 min，可根据温度和切片整体显色情况决定显色时间。一般显色时间过长会出现显色过深或背景着色，时间过短则会出现显色过浅或假阴性；尤其对部分需要定量报告的抗体如Ki67、PR、ER、Her2等更需细心观察，逐一适时终止反应。
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2 影响免疫组化染色的常见因素
2.1 组织损伤 如机械损伤、电烙手术损伤、组织变干，无论是组织固定欠佳还是染色过程中试剂覆盖组织欠佳，皆会导致组织变干后蛋白变性，抗原性丧失，表现为无色片或全片着色。
2.2 组织固定不理想 组织固定的好坏直接与抗原的保存有关，组织固定不及时，固定液的种类和浓度不恰当，固定时间过短过长皆会影响染色效果。
2.3 组织处理不当 在组织脱水、浸蜡、包埋、烤片过程中时间过长会导致抗原丢失。掌握的原则是：在石蜡能够熔化的前提下，温度越低抗原保存越好，而烤片温度常规在60℃，时间为1 h。
2.4 抗原修复不足 目前免疫组化染色结果不佳的主要原因是抗原修复不足。目前常用的高压锅法，应在喷气后再维持1.5~2 min。
2.5 抗体试剂质量问题 目前各公司生产的抗体一般都能保证产品质量，但由于运输、分装、储存等环节皆会影响产品质量，因此买回抗体后应进行测试确认不存在质量问题。
2.6 染色技术问题 免疫组化染色步骤繁多，任何一步出问题都会导致染色失败，而且染色效果与室温密切相关，因此操作者不仅应具有很强的责任心，而且在实际工作中应根据各实验室具体情况摸索出一套适合自己的工作规程。
参 考 文 献
[1] 周会芹，杨江辉，余琦，等.不同组织固定液对免疫组化结果的影响.诊断病理学杂志，2009,16(6)：478., http://www.100md.com(李建国 陈善红)