柔红霉素对K562细胞凋亡及FAKmRNA影响的研究
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【摘要】目的研究柔红霉素诱导K562细胞增殖和凋亡情况，以及调节细胞周期和FAKmRNA基因，进一步探讨通过调控FAK表达，研究抗白血病的作用机制。方法应用CCK8细胞增殖法，结合流式细胞仪检测法检测不同浓度柔红霉素在不同时间对K562细胞增殖和凋亡的影响， 应用RTPCR和Western blot技术检测不同浓度柔红霉素作用对K562细胞FAKmRNA以及蛋白表达水平的变化。结果K562细胞的增殖抑制率随着柔红霉素浓度增加及作用时间延长逐渐升高，同一浓度不同时间组之间，或者同一时间不同浓度组之间比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；柔红霉素能引起K562细胞凋亡，且随着药物浓度增加，凋亡率也逐渐增加，差异均有统计学意义(P<0.05)；柔红霉素能引起K562细胞周期阻滞，多停留在S期；柔红霉素能引起K562细胞FAKmRNA表达和FAK蛋白表达水平的降低。结论一定浓度的柔红霉素在体外可诱导细胞凋亡增加并抑制分裂期细胞的增殖，对细胞FAK基因和蛋白水平都有显著下调，发生凋亡的机制可能是通过抑制FAK基因表达。
【关键词】
白血病；K562细胞；柔红霉素；细胞增殖；凋亡；FAKmRNA
从20世纪70年代开始，蒽环类抗生素作为治疗白血病关键药物之一应用于临床，其中柔红霉素(daunorubicin，DNR)是白血病化疗的主要药物[1]。对柔红霉素(DNR)治疗作用的研究，以前仅停留在它与肿瘤细胞DNA分子的相互作用及其在体内的代谢阶段，而具体的作用机制尚不清楚。粘着斑激酶(focal adhesion kinase，pp125FAK)是一种细胞内非受体型酪氨酸激酶，在丝氨酸转化细胞的磷酸化蛋白中发现，与酪氨酸激酶2(proline rich tyrosine kinase2，PYK2)及细胞粘附激酶β(cellular adhesion kinaseβ，CAKβ)组成 FAK家族[2]。FAK在正常细胞的生长周期，增殖分化，迁移运动及血管生成等过程均发挥主要作用，并且，FAK在多种肿瘤细胞中高表达，在肿瘤细胞激活过程及侵袭转移中也起关键作用，并已逐渐成为肿瘤治疗的新靶点[3]。本实验利用一定浓度的柔红霉素体外作用于K562细胞，研究其对K562细胞的增殖和凋亡，FAKmRNA表达以及FAK蛋白的影响，进一步探讨通过调控FAK表达，研究抗白血病的作用机制。
1材料和方法
1.1试剂和细胞系人慢性粒细胞白血病急变期K562细胞，由孙逸仙纪念医院医学研究中心馈赠，柔红霉素购于深圳万乐制药厂，胎牛血清和RPMI1640培养基购于美国Gibco公司，碘化丙锭(PI)购于北京中山生物工程公司，Annexin2V/PI试剂盒购于北京宝赛生物工程公司。CCK8购于上海同仁公司，RTPCR试剂盒，RNA提取试剂盒购于Invitrogen公司。fakmRNA引物和内参NADPH购于上海英俊生物工程公司。
1.2细胞培养K562细胞培养于含有10%的胎牛血清的RPMI1640培养基中，在含5%CO2饱和湿度的培养箱中常规传代培养。每2 d换液1次，取对数生长期细胞用于各项实验。
1.3测定方法
1.3.1柔红霉素对K562细胞增殖影响的CCK8法检测
将2×10.4/ml细胞悬液接种于96孔板，每孔200ul，分别设阴性对照组和空白对照组，实验组分别立刻加入终浓度为0.15，0.3，0.6，1.2，2.4 mg/L的柔红霉素，每孔设4个复孔，培养36 h后往每孔中加入10 μlCCK8溶液，37℃温育2 h后，上酶标仪测各孔A595值。按下列公式计算细胞增殖抑制率：
增殖抑制率=(1实验孔平均OD值/对照孔平均OD值)×100%
1.3.2柔红霉素对K562细胞凋亡的FCM检测
采用Annexin2V/PI双染法FCM检测，方法参照试剂盒说明书进行，调整K562细胞浓度至2×10.5/ml，接种于6孔的培养板，每孔加入2 ml细胞液，立刻加入终浓度为0，0.15，以及0 ......
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