P38mAPK信号通路在糖尿病肾病中的作用(1)
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【摘要】 目的 探讨p38 MAPK信号通路在糖尿病肾病中的作用。方法 使用不同浓度葡萄糖及p38 mAPK特异性抑制剂SB203580干预肾小球系膜细胞，采用实时荧光定量PCR法检测各组肾小球系膜细胞p38 MAPK、MMP—9和TIMP—1 mRNA的表达。结果 高糖组p38 mAPK 、TIMP—1 mRNA的表达明显增加，且呈浓度依赖性；而MMP—9 mRNA表达和MMP—9/TIMP—1比值与正常组相比明显下降，同时 p38 MAPK抑制剂SB203580能明显逆转以上变化。结论 p38 MAPK信号通路介导了高糖诱导的肾小球系膜细胞MMP—9和TIMP—1 mRNA表达的改变，进而参与了糖尿病肾病的进展。
【关键词】 糖尿病肾病； p38丝裂原活化蛋白激酶；基质金属蛋白酶—9；基质金属蛋白酶组织抑制剂—1
糖尿病肾病是糖尿病严重的微血管并发症之一，其发病机制涉及多个方面，肾小球细胞外基质的增加是糖尿病肾病的主要病理改变。基质金属蛋白酶(MMPs)及其组织抑制剂(TIMPs)是影响细胞外基质降解的主要因素。p38 mAPK信号通路是细胞信号传递的共同通路[1，2]。MMPs和TIMPs在糖尿病肾病发生中的作用及他们与p38 mAPK信号通路的关系尚有待探讨。我们通过观察高糖刺激后大鼠肾小球系膜细胞(RMC)p38 MAPK、MMP—9和TIMP—1 mRNA的表达，以及使用p38 MAPK特异性抑制剂SB203580干预后MMP—9和TIMP—1 mRNA表达的变化，探讨p38 MAPK信号通路与MMP—9/TIMP—1在DN发生发展中的作用。
1 材料与方法
1.1 细胞与试剂 大鼠肾小球系膜细胞系(RMC)为天津医科大学代谢病医院于德民教授赠送。DMEM培养基、新生牛血清、胰蛋白酶为Gibco公司产品； SB203580、T4 dNA连接酶为Promega公司产品； M—MLV逆转录酶、Oligo(dT)18为天根生化科技有限公司产品；TRIzol、SYBRPremix Ex TaqTM 试剂盒、Taq DNA聚合酶、dNTP为大连宝生物工程有限公司产品。
1.2 细胞培养 RMC常规培养在含10%新生牛血清的低糖DMEM培养液中，置于37℃，5%CO2的细胞培养箱中培养，每2～3 d传代一次。
1.3 试验分组 ①正常对照组：5.6 mmol/L的葡萄糖。②高糖A组：10 mmol/L的葡萄糖。③高糖B组：20 mmol/L的葡萄糖。④高糖C组：30 mmol/L的葡萄糖。⑤SB203580组：30 mmol/L的葡萄糖+10 μmol/L SB203580。⑥甘露醇组：5.6 mmol/L的葡萄糖+24.4 mmol/L的甘露醇。
1.4 实时荧光定量PCR 各组细胞分别用以上各处理因素培养72 h后，按照Trizol试剂说明书提取细胞总RNA，按逆转录试剂盒说明书逆转录成cDNA，再以等量的cDNA为模板按照实时荧光定量PCR试剂盒说明书进行定量PCR反应。制备各目的基因的标准品，并绘制标准曲线，各基因引物为自行设计并由上海英骏公司合成，各基因引物序列如下：p38 mAPK上游引物：5—GAACAAGACCGTCTGGGAGGTGC—3，下游引物：5—TTGGCGTGAATG ATGGACTGAAA—3；MMP—9上游引物：5—AAAGGTCGCTCGGATGGTTATC G—3，下游引物：5—TACTCTTGCCCAGG AAGACGAA—3；TIMP—1上游引物：5—CCAGTAAAGCCTGTAGCTGTGCC—3，下游引物：5—AGCGTCGAATCCTTT GAGCTCTTA—3，同时扩增管家基因β—actin序列作为内参照。以各目的基因和管家基因表达量的比值作为各目的基因相对表达量。
1.5 统计学方法 所得数据均以均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用Student—Newman—Keuls检验。P<0.05被认为有统计学意义。
2 结果
2.1 高糖B组、高糖C组、SB203580组和甘露醇组p38 mAPK mRNA表达明显高于正常组，差别均有统计学意义(P<0.05)，且随着葡萄糖浓度的增加p38 mAPK mRNA表达逐渐增加。
2.2 高糖B组、高糖C组和甘露醇组MMP—9 mRNA表达水平均低于正常组，差别均有统计学意义(P<0.05)，且随着葡萄糖浓度的增加，MMP—9 mRNA表达水平逐渐下降； SB203580组的MMP—9 mRNA表达水平变化与正常组相比没有统计学意义(P>0.05)，而明显高于高糖C组(P<0.05)。
2.3 高糖B组、高糖C组和甘露醇组的TIMP—1 mRNA的表达水平明显增加，与正常组相比差别均有统计学意义(P<0.05)，且随着葡萄糖浓度的增加，TIMP—1 mRNA的表达水平逐渐增加； SB203580组的MMP—9 mRNA表达水平变化与正常组相比没有统计学意义(P>0.05)；而明显低于高糖C组(P<0.05)。
3 讨论
肾小球细胞外基质增加是糖尿病肾病时肾组织的主要病理改变，有关它的发生机制受到人们的普遍关注。一般情况下，肾小球细胞外基质积聚的程度依赖于基质合成与降解两条途径的精细平衡，正常生理状态下，细胞外基质合成与降解之间相互协调，相互制约，在体内始终保持着动态平衡，当这种动态平衡遭到破坏时 ......
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