RhoA在乳腺癌中表达的研究(1)
【摘要】 目的 探讨RhoA在人乳腺癌中表达的情况及其意义。方法 免疫组化S-P法和Western blot方法检测乳腺癌以及良性乳腺疾病组织中RhoA蛋白的表达情况。结果 ①RhoA蛋白在乳腺癌组织中的阳性表达明显优于乳腺良性疾病组织中的表达， 差异具有统计学意义(P<0.05)。 ②病理组织学分级(SBR分级)、淋巴结转移的有无与RhoA蛋白在乳腺癌中表达有关， 与患者年龄、肿瘤大小和临床分期无关。结论 RhoGTPase家族成员RhoA蛋白在乳腺癌中的高表达说明其与乳腺癌的发生、发展的临床效果关系密切。为深入研究和使用RhoA抑制剂抑制乳腺肿瘤发生和发展的临床过程提供实验依据。
【关键词】 RhoGTPase;RhoA;乳腺癌
DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.03.031
恶性肿瘤的重要特征是侵袭和转移， 这些特征也是患者死亡的主要原因。随着对肿瘤转移基因调控的多阶段、多因素、多步骤理论的研究不断跟进， 对于这一复杂病理过程有了更深入的认识。在人体肿瘤中， RhoA蛋白的异常表达使肿瘤细胞运动能力增强并促进其迁徙， 因此与肿瘤的发生、发展密切相关[1]。
, 百拇医药
1 资料与方法
1. 1 一般资料 2014年1月～2014年6月期间在本院接受手术的女性患者120例。其中完整的乳腺癌蜡块标本60例、良性乳腺疾病标本蜡块20例， 手术切除的乳腺癌新鲜组织标本20例、良性乳腺疾病新鲜组织标本20例， 存放于-80℃冰箱冻存。年龄26～79岁， 平均年龄49岁。所有患者术前均未做放疗、化疗和内分泌治疗。乳腺癌标本均经病理证实为浸润性导管癌。
1. 2 方法
1. 2. 1 免疫组织化学检测采用免疫组织化学SP法。RhoA多克隆抗体购于Santa Cruz公司、ALP标记的山羊抗兔、山羊抗小鼠第二抗体、S-P试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色剂盒均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。严格按照说明书操作(一抗稀释度：RhoA 1：100)。
1. 2. 2 Western Blot 检测手术切除的组织块加入裂解液裂解后离心取上清。向样品中加入500 μl RIPA缓冲液(1%NP-40， 5%脱氧胆酸钠， 5%SDS， 0.1%PMSF)，离心取上清。考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度， 准确吸取50 μg蛋白质， 100 V电泳至溴酚蓝出胶。将凝胶贴于PVDF膜上， 25 V转印30 min， 5%脱脂奶粉封闭液中摇床过夜， 加入1：1000稀释的一抗摇床上杂交2 h， 加入1：5000稀释的二抗摇床杂交， 漂洗后显色。应用Chemi-Genius凝胶分析系统分析条带灰度值。
, 百拇医药
1. 3 结果判断标准 由病理科医师协助免疫组化结果判定。RhoA蛋白的表达呈弥漫性棕黄或棕褐色颗粒多呈现在乳腺癌的细胞质。大多数良性乳腺疾病的细胞质内未见或少见这种着色。癌细胞的每张切片先在低倍镜下观察， 这样可确定癌组织部位， 然后再在高倍镜下观察， 每张切片随机的选择10个高倍视野， 输入细胞图像分析系统， 记录阳性细胞的个数， 并计算阳性细胞百分率。RhoA蛋白阳性细胞可见细胞质显示棕黄或棕褐色， 判定标准是以阳性细胞数<10%定为阴性(-)， 阳性细胞数≥10%定为阳性(+)。
1. 4 统计学方法 数据分析使用SPSS17.0统计学软件。计量资料以均数±标准差( x-±s)表示， 采用t检验;计数资料以率(%)表示， 采用χ2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果
2. 1 Western Blot检测RhoA蛋白在乳腺组织中的表达 RhoA蛋白在20例良性乳腺疾病组织中呈低表达， 灰度值为(36625.34±562.20)，在20例乳腺癌组织中呈高表达， 灰度值为(59634.78±184.44)。RhoA蛋白在乳腺癌组织中的表达值显著高于良性乳腺疾病组织， 且差异有统计学意义(P<0.05)。
, 百拇医药
2. 2 免疫组化法测定RhoA蛋白在乳腺癌组织和良性乳腺疾病组织中的表达情况 RhoA在良性乳腺疾病组织中呈低表达(41%)， 乳腺癌中呈高表达(76%)。RhoA蛋白在乳腺癌组织中表达的阳性率显著高于良性乳腺疾病组织， 差异明显， 且具有统计学意义(P<0.05)。
3 讨论
肿瘤转移高度相关的基因的发现及证实， 已经成为当前肿瘤转移机制研究的热点， 原因是这些基因及其产物是一种重要的研究癌细胞的指标， 对治疗癌症患者具有重要意义。Rho家族蛋白是Ras超家族中最早被发现的一种能克隆的一种蛋白， 它们的相对分子质量大约为20～25 kD， 并与三磷酸鸟苷(guanosine triphosphate， GTP)结合而成的蛋白， 具有GTP酶活性， 也可称为Rho GTP酶。RhoA是Rho亚家族的成员， 主要参与张力纤维形成和粘着斑复合体(focal adhesion complexs， FACs)组装[2]。
, 百拇医药
Rho GTP酶的工作原理和Ras超家族的其他成员一样， 就是羧基端通常具有共同结构域。Rho GTP酶经翻译后修饰， 这样的Rho GTP酶才具有活性， 才可能与细胞膜上适宜的脂质分子结合， 发挥其作用。Rho GTP酶是细胞内信息传播的介质， 在细胞内的信号转导中发挥桥梁作用。如在RhoA/ROCK-2细胞通路中， 在血管内皮生长因子VEGF-C的参与下， 可促进宫颈癌的侵袭和转移[3]。Rho GTP酶还可调节正常细胞的增殖、分化、凋亡， 并关系到肿瘤的发生和转移。通过实验研究发现， Rho GTP酶的异常表达可在多种肿瘤中发现， 细胞内Rho GTP酶的表达的改变直接影响到肿瘤细胞的侵袭和转移。活化的RhoA可促进骨肉瘤的转移[4]。Rho GTP酶中尤其是RhoA是关键的调控因子， 主要参与对细胞形态改变， 细胞与基质粘附及细胞骨架重组的调控， 调节肿瘤细胞的侵袭转移过程[5]。GTPases的羧基甲基化和等离子体膜易位可以通过叶酸进行调节， 研究表明缺乏叶酸会导致这些蛋白质保留在内质网， 减少肺癌细胞的侵袭和转移。非活化(GDP-bound) GTPases向活化的(GTP-bound)GTPases导致下游激酶的活化， PAK、 LIMK和肌动蛋白的磷酸化过程中叶酸起到一定的作用， 其作用通过 RhoA 和Rac1进行，但不是Cdc42。通过针对RhoA或Rac1做为靶点可阻断叶酸对磷酸化和细胞迁移和入侵的影响， 进一步控制恶性肿瘤的发展。, 百拇医药(刘永智)
【关键词】 RhoGTPase;RhoA;乳腺癌
DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.03.031
恶性肿瘤的重要特征是侵袭和转移， 这些特征也是患者死亡的主要原因。随着对肿瘤转移基因调控的多阶段、多因素、多步骤理论的研究不断跟进， 对于这一复杂病理过程有了更深入的认识。在人体肿瘤中， RhoA蛋白的异常表达使肿瘤细胞运动能力增强并促进其迁徙， 因此与肿瘤的发生、发展密切相关[1]。
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1 资料与方法
1. 1 一般资料 2014年1月～2014年6月期间在本院接受手术的女性患者120例。其中完整的乳腺癌蜡块标本60例、良性乳腺疾病标本蜡块20例， 手术切除的乳腺癌新鲜组织标本20例、良性乳腺疾病新鲜组织标本20例， 存放于-80℃冰箱冻存。年龄26～79岁， 平均年龄49岁。所有患者术前均未做放疗、化疗和内分泌治疗。乳腺癌标本均经病理证实为浸润性导管癌。
1. 2 方法
1. 2. 1 免疫组织化学检测采用免疫组织化学SP法。RhoA多克隆抗体购于Santa Cruz公司、ALP标记的山羊抗兔、山羊抗小鼠第二抗体、S-P试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色剂盒均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。严格按照说明书操作(一抗稀释度：RhoA 1：100)。
1. 2. 2 Western Blot 检测手术切除的组织块加入裂解液裂解后离心取上清。向样品中加入500 μl RIPA缓冲液(1%NP-40， 5%脱氧胆酸钠， 5%SDS， 0.1%PMSF)，离心取上清。考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度， 准确吸取50 μg蛋白质， 100 V电泳至溴酚蓝出胶。将凝胶贴于PVDF膜上， 25 V转印30 min， 5%脱脂奶粉封闭液中摇床过夜， 加入1：1000稀释的一抗摇床上杂交2 h， 加入1：5000稀释的二抗摇床杂交， 漂洗后显色。应用Chemi-Genius凝胶分析系统分析条带灰度值。
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1. 3 结果判断标准 由病理科医师协助免疫组化结果判定。RhoA蛋白的表达呈弥漫性棕黄或棕褐色颗粒多呈现在乳腺癌的细胞质。大多数良性乳腺疾病的细胞质内未见或少见这种着色。癌细胞的每张切片先在低倍镜下观察， 这样可确定癌组织部位， 然后再在高倍镜下观察， 每张切片随机的选择10个高倍视野， 输入细胞图像分析系统， 记录阳性细胞的个数， 并计算阳性细胞百分率。RhoA蛋白阳性细胞可见细胞质显示棕黄或棕褐色， 判定标准是以阳性细胞数<10%定为阴性(-)， 阳性细胞数≥10%定为阳性(+)。
1. 4 统计学方法 数据分析使用SPSS17.0统计学软件。计量资料以均数±标准差( x-±s)表示， 采用t检验;计数资料以率(%)表示， 采用χ2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果
2. 1 Western Blot检测RhoA蛋白在乳腺组织中的表达 RhoA蛋白在20例良性乳腺疾病组织中呈低表达， 灰度值为(36625.34±562.20)，在20例乳腺癌组织中呈高表达， 灰度值为(59634.78±184.44)。RhoA蛋白在乳腺癌组织中的表达值显著高于良性乳腺疾病组织， 且差异有统计学意义(P<0.05)。
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2. 2 免疫组化法测定RhoA蛋白在乳腺癌组织和良性乳腺疾病组织中的表达情况 RhoA在良性乳腺疾病组织中呈低表达(41%)， 乳腺癌中呈高表达(76%)。RhoA蛋白在乳腺癌组织中表达的阳性率显著高于良性乳腺疾病组织， 差异明显， 且具有统计学意义(P<0.05)。
3 讨论
肿瘤转移高度相关的基因的发现及证实， 已经成为当前肿瘤转移机制研究的热点， 原因是这些基因及其产物是一种重要的研究癌细胞的指标， 对治疗癌症患者具有重要意义。Rho家族蛋白是Ras超家族中最早被发现的一种能克隆的一种蛋白， 它们的相对分子质量大约为20～25 kD， 并与三磷酸鸟苷(guanosine triphosphate， GTP)结合而成的蛋白， 具有GTP酶活性， 也可称为Rho GTP酶。RhoA是Rho亚家族的成员， 主要参与张力纤维形成和粘着斑复合体(focal adhesion complexs， FACs)组装[2]。
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Rho GTP酶的工作原理和Ras超家族的其他成员一样， 就是羧基端通常具有共同结构域。Rho GTP酶经翻译后修饰， 这样的Rho GTP酶才具有活性， 才可能与细胞膜上适宜的脂质分子结合， 发挥其作用。Rho GTP酶是细胞内信息传播的介质， 在细胞内的信号转导中发挥桥梁作用。如在RhoA/ROCK-2细胞通路中， 在血管内皮生长因子VEGF-C的参与下， 可促进宫颈癌的侵袭和转移[3]。Rho GTP酶还可调节正常细胞的增殖、分化、凋亡， 并关系到肿瘤的发生和转移。通过实验研究发现， Rho GTP酶的异常表达可在多种肿瘤中发现， 细胞内Rho GTP酶的表达的改变直接影响到肿瘤细胞的侵袭和转移。活化的RhoA可促进骨肉瘤的转移[4]。Rho GTP酶中尤其是RhoA是关键的调控因子， 主要参与对细胞形态改变， 细胞与基质粘附及细胞骨架重组的调控， 调节肿瘤细胞的侵袭转移过程[5]。GTPases的羧基甲基化和等离子体膜易位可以通过叶酸进行调节， 研究表明缺乏叶酸会导致这些蛋白质保留在内质网， 减少肺癌细胞的侵袭和转移。非活化(GDP-bound) GTPases向活化的(GTP-bound)GTPases导致下游激酶的活化， PAK、 LIMK和肌动蛋白的磷酸化过程中叶酸起到一定的作用， 其作用通过 RhoA 和Rac1进行，但不是Cdc42。通过针对RhoA或Rac1做为靶点可阻断叶酸对磷酸化和细胞迁移和入侵的影响， 进一步控制恶性肿瘤的发展。, 百拇医药(刘永智)