常用流感病毒实验室检测方法的比较
【摘要】 目的 通过对四种常用流感病毒检测方法的比较， 确定适用于常规监测及疫情暴发时的检测方法。方法 用四种方法对随机抽取的50份样品进行检测， 对结果进行对比分析。结果 胶体金法虽简单快速， 但漏检率较高(20.00%)；RT-PCR法灵敏快捷， 准确度高(34.00%)；细胞培养法费用适中， 检出率较高(14.00%)；鸡胚培养法检出率最低(2.00%)。结论 胶体金法适合疫情现场检测， RT-PCR法适合实验室内快速检测， 组织培养法适合常规监测， 鸡胚培养法适合流感疫苗生产。
【关键词】 组织培养；鸡胚培养；病毒分离；RT-PCR；流感病毒
DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.30.215
现在实验室对流感病毒的检测手段有很多种， 在本科室常用的方法有胶体金法、细胞培养法、鸡胚培养法、RT-PCR法四种。为实际工作中找到最适合的检测方法， 更及时准确的提供检测结果， 对实验室常用的四种流感病毒检测方法进行比较。现报告如下。
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1 资料与方法
1. 1 检测样品 2014年1～4月份本院对就诊的流感样病例(发热， 体温≥38℃， 伴咳嗽或咽痛之一者， 未服用过抗病毒药物[1])采集的鼻咽拭子， 随机抽取50份。流感病毒采样管由北京友康恒业科技有限公司购买。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 胶体金法 美国QUIDEL公司， QuickVue Influenza A+B Test， 按照试剂盒说明书操作。
1. 2. 2 细胞培养法 MDCK细胞由辽宁省疾病预防控制中心提供。样品前处理：将采样管漩涡震荡10 s， 反复挤压拭子头后弃去拭子， 加入青霉素、链霉素、制霉菌素， 4℃静置2 h。细胞传代及病毒接种按照郭元吉等所著的《流行性感冒病毒及其实验技术》操作[2]。样品接种MDCK细胞培养出的第一代病毒培养液用1%豚鼠血红血球进行微量血凝实验(haemagglutination assay， HA)， HA≥1：8的第一代病毒培养液用血凝抑制法(hemagglutination inhibition， HI)进行流感病毒分型鉴定(鉴定试剂盒由国家流感中心提供)。HA<1：8的第一代病毒培养液再次接种MDCK细胞增毒， 增毒后HA≥1：8的第二代病毒培养液用HI法进行流感病毒分型鉴定， HA<1：8的第二代病毒培养液用RT-PCR法进行流感病毒分型鉴定。第一代病毒培养液HA为阴性的再次接种MDCK细胞， 盲传一代后仍为阴性的报告未检出流感病毒。
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1. 2. 3 鸡胚培养法 9～11日龄无特定病原菌(specific pathogen free， SPF)鸡胚蛋由北京梅里亚维通实验动物技术有限公司购买。双腔接种法按照郭元吉等所著的《流行性感冒病毒及其实验技术》操作[2]。样品前处理、增毒、盲传、鉴定方法同组织培养法。
1. 2. 4 RT-PCR法 病毒RNA提取用Neasy Mini Kit， 荧光扩增用上海之江生物科技有限公司的甲型流感病毒核酸测定试剂盒、乙型流感病毒核酸测定试剂盒、甲型流感病毒H1亚型及H3亚型核酸联合测定试剂盒、新型甲型流感病毒(H1N1)核酸测定试剂盒， 按照试剂盒说明书操作。
2 结果
用四种方法分别对50份鼻咽拭子进行检测， 因检测所用的鼻咽拭子是-70℃冷冻保存过的， 且拭子上病毒经过保存液稀释， 所以胶体金法检测结果阳性偏低， 并且本次检测使用的胶体金试剂盒只能检测季节性人流感A(H1N1亚型和H3N2亚型)以及流感B， 对新H1N1型流感病毒检测能力还不确定。组织培养法检测结果显示第一代HA为阳性的7个样品中5个病毒培养液 HA≥1∶32， 2个HA<1∶8的病毒培养液经增毒后HA≥1∶16。鸡胚培养法只检测出1个HA为阳性的样品， 且增毒后仍然HA<1∶8， 用RT-PCR法鉴定出亚型。组织培养法和鸡胚培养法检测HA为阴性的样品经盲传后HA仍为阴性。RT-PCR法检测为阴性的样品其他方法检测也都为阴性， 其他方法检测为阳性的样品RT-PCR法无漏检， 说明此法准确率最高。采用不同检测方法检测结果为阳性的同一份样品， 鉴定结果均为同型流感病毒。结果显示RT-PCR法检出率最高， 鸡胚培养法检出率最低。见表1。
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3 讨论
四种检测方法各有优缺点：①胶体金法。优点：操作方法简单， 耗时短(≤20 min)；不需仪器设备， 方便携带， 适合有疫情爆发时现场快速检测；平均每份样品费用低；缺点：漏检率高， 且只能鉴定出流感病毒的A、B型， 不能进行亚型鉴定。②细胞培养法。优点：细胞可大量繁殖， 受外界影响小， 经济方便；分离到的病毒抗原性和基因特性比鸡胚分离到的更接近原始采集到的样本[2]。缺点：病毒不能长期保存， 病毒培养液随保存时间延长滴度下降；传代细胞含致癌因子， 不能用于疫苗生产；随着细胞传代增加， 对病毒敏感性下降[2]；对实验人员技术水平要求较高；实验用试剂耗材费用较高；实验耗时较长， 一般需3～14 d出具结果。③鸡胚培养法。优点：鸡胚蛋来源充足， 对正粘病毒敏感， 通常是无菌的， 实验操作简单；对病毒不产生抗体， 利于病毒复制[2]。缺点：无特异性的感染指征；阳性检出率低， 漏检率太高；实验耗时较长， 总费用高， 经常需要连续传代以提高HA滴度， 费时费力[3]。④RT-PCR法。优点：特异性强， 灵敏度高， 病毒含量很低的样品也能检出；实验耗时短(4 h内能出具初步鉴定结果)；可对HA<1：8或HI结果不明确的病毒培养液进行鉴定。
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综上所述， 在有流感疫情爆发， 需要进行现场检测时， 适合使用胶体金法；需要快速出具准确诊断结果时， 适合使用RT-PCR法；组织培养法适合常规监测；鸡胚培养法适合流感疫苗生产。
参考文献
[1] 赵慧， 江征， 李娟， 等. 流感病毒中和抗体检测方法的建立及验证. 中国生物制品当杂志， 2014， 27(9)：1109-1201， 1206.
[2] 郭元吉， 程小雯.流行性感冒病毒及其实验技术.北京：中国三峡出版社， 1997：87-96.
[3] 马辑红， 何华， 高枫， 等.流感病毒实验室检测方法的比较和改进.中国卫生检验杂志， 2006， 16(9)：1131-1141.
[收稿日期：2015-05-13], http://www.100md.com(尚雪颖)
【关键词】 组织培养；鸡胚培养；病毒分离；RT-PCR；流感病毒
DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.30.215
现在实验室对流感病毒的检测手段有很多种， 在本科室常用的方法有胶体金法、细胞培养法、鸡胚培养法、RT-PCR法四种。为实际工作中找到最适合的检测方法， 更及时准确的提供检测结果， 对实验室常用的四种流感病毒检测方法进行比较。现报告如下。
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1 资料与方法
1. 1 检测样品 2014年1～4月份本院对就诊的流感样病例(发热， 体温≥38℃， 伴咳嗽或咽痛之一者， 未服用过抗病毒药物[1])采集的鼻咽拭子， 随机抽取50份。流感病毒采样管由北京友康恒业科技有限公司购买。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 胶体金法 美国QUIDEL公司， QuickVue Influenza A+B Test， 按照试剂盒说明书操作。
1. 2. 2 细胞培养法 MDCK细胞由辽宁省疾病预防控制中心提供。样品前处理：将采样管漩涡震荡10 s， 反复挤压拭子头后弃去拭子， 加入青霉素、链霉素、制霉菌素， 4℃静置2 h。细胞传代及病毒接种按照郭元吉等所著的《流行性感冒病毒及其实验技术》操作[2]。样品接种MDCK细胞培养出的第一代病毒培养液用1%豚鼠血红血球进行微量血凝实验(haemagglutination assay， HA)， HA≥1：8的第一代病毒培养液用血凝抑制法(hemagglutination inhibition， HI)进行流感病毒分型鉴定(鉴定试剂盒由国家流感中心提供)。HA<1：8的第一代病毒培养液再次接种MDCK细胞增毒， 增毒后HA≥1：8的第二代病毒培养液用HI法进行流感病毒分型鉴定， HA<1：8的第二代病毒培养液用RT-PCR法进行流感病毒分型鉴定。第一代病毒培养液HA为阴性的再次接种MDCK细胞， 盲传一代后仍为阴性的报告未检出流感病毒。
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1. 2. 3 鸡胚培养法 9～11日龄无特定病原菌(specific pathogen free， SPF)鸡胚蛋由北京梅里亚维通实验动物技术有限公司购买。双腔接种法按照郭元吉等所著的《流行性感冒病毒及其实验技术》操作[2]。样品前处理、增毒、盲传、鉴定方法同组织培养法。
1. 2. 4 RT-PCR法 病毒RNA提取用Neasy Mini Kit， 荧光扩增用上海之江生物科技有限公司的甲型流感病毒核酸测定试剂盒、乙型流感病毒核酸测定试剂盒、甲型流感病毒H1亚型及H3亚型核酸联合测定试剂盒、新型甲型流感病毒(H1N1)核酸测定试剂盒， 按照试剂盒说明书操作。
2 结果
用四种方法分别对50份鼻咽拭子进行检测， 因检测所用的鼻咽拭子是-70℃冷冻保存过的， 且拭子上病毒经过保存液稀释， 所以胶体金法检测结果阳性偏低， 并且本次检测使用的胶体金试剂盒只能检测季节性人流感A(H1N1亚型和H3N2亚型)以及流感B， 对新H1N1型流感病毒检测能力还不确定。组织培养法检测结果显示第一代HA为阳性的7个样品中5个病毒培养液 HA≥1∶32， 2个HA<1∶8的病毒培养液经增毒后HA≥1∶16。鸡胚培养法只检测出1个HA为阳性的样品， 且增毒后仍然HA<1∶8， 用RT-PCR法鉴定出亚型。组织培养法和鸡胚培养法检测HA为阴性的样品经盲传后HA仍为阴性。RT-PCR法检测为阴性的样品其他方法检测也都为阴性， 其他方法检测为阳性的样品RT-PCR法无漏检， 说明此法准确率最高。采用不同检测方法检测结果为阳性的同一份样品， 鉴定结果均为同型流感病毒。结果显示RT-PCR法检出率最高， 鸡胚培养法检出率最低。见表1。
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3 讨论
四种检测方法各有优缺点：①胶体金法。优点：操作方法简单， 耗时短(≤20 min)；不需仪器设备， 方便携带， 适合有疫情爆发时现场快速检测；平均每份样品费用低；缺点：漏检率高， 且只能鉴定出流感病毒的A、B型， 不能进行亚型鉴定。②细胞培养法。优点：细胞可大量繁殖， 受外界影响小， 经济方便；分离到的病毒抗原性和基因特性比鸡胚分离到的更接近原始采集到的样本[2]。缺点：病毒不能长期保存， 病毒培养液随保存时间延长滴度下降；传代细胞含致癌因子， 不能用于疫苗生产；随着细胞传代增加， 对病毒敏感性下降[2]；对实验人员技术水平要求较高；实验用试剂耗材费用较高；实验耗时较长， 一般需3～14 d出具结果。③鸡胚培养法。优点：鸡胚蛋来源充足， 对正粘病毒敏感， 通常是无菌的， 实验操作简单；对病毒不产生抗体， 利于病毒复制[2]。缺点：无特异性的感染指征；阳性检出率低， 漏检率太高；实验耗时较长， 总费用高， 经常需要连续传代以提高HA滴度， 费时费力[3]。④RT-PCR法。优点：特异性强， 灵敏度高， 病毒含量很低的样品也能检出；实验耗时短(4 h内能出具初步鉴定结果)；可对HA<1：8或HI结果不明确的病毒培养液进行鉴定。
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综上所述， 在有流感疫情爆发， 需要进行现场检测时， 适合使用胶体金法；需要快速出具准确诊断结果时， 适合使用RT-PCR法；组织培养法适合常规监测；鸡胚培养法适合流感疫苗生产。
参考文献
[1] 赵慧， 江征， 李娟， 等. 流感病毒中和抗体检测方法的建立及验证. 中国生物制品当杂志， 2014， 27(9)：1109-1201， 1206.
[2] 郭元吉， 程小雯.流行性感冒病毒及其实验技术.北京：中国三峡出版社， 1997：87-96.
[3] 马辑红， 何华， 高枫， 等.流感病毒实验室检测方法的比较和改进.中国卫生检验杂志， 2006， 16(9)：1131-1141.
[收稿日期：2015-05-13], http://www.100md.com(尚雪颖)