解毒化瘀含药血清抗白血病细胞K562及K562/A的体外实验研究
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【摘要】 目的 以解毒化瘀法立意,选取解毒化瘀中药复方,拟通过体外细胞培养证实其是否存在抗白血病细胞及多药耐药白血病细胞的作用。方法 采用MTT比色法,选择白血病细胞K562及阿霉素诱导的白血病多药耐药细胞株K562/A为靶细胞,观察不同浓度解毒化瘀含药兔血清对其细胞毒作用。结果 解毒化瘀含药兔血清对K562及K562/A均有明显的抑制作用,且其对K562/A的细胞毒作用呈剂量依赖性。结论 解毒化瘀中药在抑制白血病细胞生长及白血病多药耐药细胞生长方面具有深入研究的价值。
【关键词】解毒化瘀;白血病;多药耐药;体外细胞培养
DOI:10.3760/cma.j.issn 1673-8799.2010.06.115
作者单位:550002贵阳中医学院2007级硕士研究生
1 材料与方法
1.1 细胞株 白血病细胞株K562在含10%FBS的IMDM培养基中培养。阿霉素(ADR)诱导的白血病多药耐药细胞株K562/A[1],在含10%FBS的IMDM培养基中添加1 μg/ml的ADR 以维持其耐药性,实验前两周脱离ADR培养。K562及K562/A均由中国医学科学院血液学研究所药理实验室提供。
1.2 药品及主要试剂 IMDM 培养基,美国GIBCO公司产品; 四氮唑蓝(MTT),美国AMRESCO 公司产品;注射用盐酸多柔比星速溶型,Pfizer Italia S.r.l.公司产品。
1.3 实验方法
1.3.1 含药血清的制作 新西兰大白兔10只随机分为2组,分别为实验组和对照组。实验组以解毒化瘀中药汤剂灌胃,2次/d,连续3 d;对照组以等剂量生理盐水灌胃,2次/d,连续3 d。于末次灌胃后2 h,心脏取血。分离血清,将同组血清混匀,过滤分装,零下20℃保存备用。
1.3.2 MTT法检测含药血清的细胞毒作用 按周氏改良MTT法[2]。①接种细胞:分别收集K562及K562/A细胞悬液,离心,弃上清,用含2.5%血清的IMDM培养液配成单个细胞悬液,在EP 管中与占总体积50%,依不同比例稀释的含药血清混匀,并调整细胞浓度为1×105/ml,于96 孔板中每孔接种混悬液 100 μl,另设对照孔、空白对照孔及调零孔; ②培养细胞:将96 孔板移入CO2 培养箱中,37 ℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养48 h ; ③显色:48 h 后每孔加入MTT液(5 g/L) 20 μl,CO2 培养中,37 ℃、5%CO2、饱和湿度条件下继续培养4 h,每孔加入三联溶解液100 μl,37 ℃温箱中静置12 h,使结晶充分溶解;④比色:在酶标仪上测550 nm处光吸收度(OD550),实验重复3次。
1.4 计算方法 由OD值计算生长抑制率,公式为:细胞生长抑制率IR=[1-(实验组OD值-空白对照组OD值)/(对照组OD值-空白对照组OD值)]×100%。由SPSS14.0软件求得回归方程。
2 结果
2.1 10%解毒化瘀含药兔血清对K562和K562/A细胞的生长有明显抑制作用,等剂量对照组兔血清及胎牛血清对K562和K562/A细胞的生长无明显抑制作用,且呈增殖作用,K562和K562/A对不同血清的反应见表1。
表1
不同血清对K562和K562/A的生长抑制率(x±s,%)
细胞10%解毒化瘀含药兔血清10%空白组兔血清10%胎牛血清
K56284.26±0.04-6.21±0.03-14.13±0.03
K562/A90.65±0.04-23.95±0.02-28.62±0.01
注:n=3
2.2 K562/A细胞在解毒化瘀含药血清1:14-1:1等8个浓度范围的生长抑制曲线见图1。结果显示:解毒化瘀含药血清对K562/A细胞的细胞毒作用呈剂量依赖性。解毒化瘀含药血清对K562/A细胞生长抑制作用的概率单位回归方程为PROBIT(p)=-0.062+5.093X
图1 8个浓度含药血清作用于K562/A的生长抑制情况
3 讨论
中医药临床应用是综合治疗恶性肿瘤的重要措施,特别是晚期肿瘤患者以中医药为主治疗可明显提高生活质量,延长生存期。对其疗效机制多数文献认为与中药的整体调节、免疫调控有密切关系。而且,中药与化疗伍用还具有较为显著的增效减毒作用。除此以外,中药直接杀伤肿瘤细胞、诱导肿瘤细胞凋亡与分化以及中药逆转多药耐药效应也是中药治疗恶性肿瘤重要机制之一。
白血病是造血系统常见的恶性肿瘤,化疗是治疗的主要手段之一,然而白血病细胞产生耐药性是化疗失败的主要原因。关于白血病MDR的逆转研究,国内外早已有报道,已发现异博定能通过增加细胞内药物浓度来逆转抗癌药物,但毒副作用限制了其应用[3]。寻找高效、低毒,能克服MDR的逆转剂有着十分重要的意义。近年来从中草药中筛选有效逆转剂的体外研究已逐渐开展,也取得了一定成绩。
中医认为白血病多药耐药产生主要是由于毒邪留恋,扰乱血络,导致毒瘀互结,病情顽缠,反复发作[4]。在此中医理论指导下,笔者以解毒化瘀为法,应用解毒化瘀药(药物青黛、山慈菇、蚤休、虎杖、莪术、川芎、丹参、补骨脂等组成)联合西药化疗应用于临床,提高难治性或复发性白血病的缓解率,减轻化疗毒副作用,临床取得了良好的效果。方中的青黛[5]、山慈菇[6]、蚤休[7]、虎杖[8]、莪术[9]、川芎[10]、丹参[11]、补骨脂[12]均具有抗肿瘤及逆转多药耐药的作用。
本研究仿效NCI研究模式,以MTT法检测解毒化瘀含药血清在不同时间,不同浓度时对白血病细胞的生长抑制率。因研究领域为血液系统肿瘤,故选用白血病细胞K562、K562/A。K562和K562/A为半贴壁细胞,为保证实验结果的稳定性,本实验并未采用常用的MTT法,而是采用了周建军等报道的改良MTT法。此法在完成培养后,无需弃去上清,加入DMSO,而是直接加入三联溶解液,溶解蓝紫色formazan颗粒,避免丢失部分悬浮细胞生成的formazan颗粒,使得结果更加稳定可靠。
本实验用MTT法检测解毒化瘀含药血清的细胞毒性时发现,解毒化瘀含药血清能抑制K562和K562/A细胞的生长,且其细胞毒作用呈剂量依赖性,提示解毒化瘀复方中药具有明显的抗白血病细胞及多药耐药细胞的作用,可进一步探讨其是否具有逆转肿瘤多药耐药的作用。
参考文献
[1] 杨纯正.阿霉素诱导的人白血病细胞系K562/A02多药耐药性.中国药理学报,1995,16(4):333.
[2] 周建军.评价抗癌物质活性的改良MTT法.中国医药工业杂志,1993,24(10):455-457 ......
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