E-钙粘素在结直肠癌中的表达及其与淋巴结微转移的关系(2)
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1.2 方法
1.2.1 总RNA的抽提 采用标准TRIzol法(参照说明书)提取术后淋巴结标本的总RNA,凝胶电泳和分光光度计检测RNA浓度和纯度。
1.2.2 cDNA制备 总RNA样品1 μl,依次加入Oligo dT(18)0.5 μl,MgCl2 2 μl,10×RT Buffer 1 μl,RNase Free dH2O 3.75 μl,10 mmol/L dNTP 1 μl,RNase Inhibitor 0.25 μl,AMV Reverse Transcriptase 0.5 μl。总反应混合物于30℃反应10 min,42℃反应30 min,99℃反应5 min,5℃反应5 min。
1.2.3 引物的合成 在NCBI数据库中查找编码人类基因CK20的核酸序列,其登录号为NM_019010,该序列长1817 bp,编码序列CDS(Coding Sequence)位于43-1317 bp间。以此序列为基础,在CDS区内设计引物。上游引物5’-ACCTAAATGACCGTCTAGCGAGC-3’下游引物5’-CACATTGACAGTGTTGCCCAGAT-3’扩增片段为449 bp大小,引物由上海英俊公司合成。
1.2.4 PCR反应和分析 采用RT-PCR方法,以人结直肠癌淋巴结cDNA为模版.反应体系为50 μl:cDNA模版1 μl,10× LA PCR缓冲液5 μl,25 mmol/L MgCl2 5 μl,20 pmol/μl 上游和下游引物各1 μl,10 mmol/L dNTP Mixture 2 μl,LATag酶0.5 μl,补去离子水至50 μl。PCR反应条件:94℃预变性3 min;94℃变性30 s,58.5℃退火30 s,72℃延伸1 min,30个循环;72℃再延伸5 min。反应完毕后进行电泳分析。
1.2.5 结直肠癌组织切片厚4 μm,0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液微波抗原修复,S-P免疫组化染色。染色步骤按说明书进行,DAB显色,苏木精复染胞核。PBS代替第1抗体作阴性对照。
1.3 统计学方法 资料的统计分析在SPSS13.0软件包中进行,数值变量以均数(95%可信区间)表示,计数资料用率来表示,两组间率的比较采用χ2检验法。并采用诊断性实验分析方法计算CK20与传统病理切片技术诊断结直肠癌淋巴结转移的准确度、敏感度和特异度。
实验结果:
图A E-Cadherin在正常大肠黏膜上皮细胞中的表达 40×
图B E-Cadherin在结直肠癌组织中的表达 40×
2 结果
2.1 60例散发性结直肠癌患者的782个受检淋巴结经常规病理学检查,34例(56.7%)患者有淋巴结转移,阳性淋巴结总数为356个(45.5%)。而采用RT-PCR法检测CK20 mRNA的表达情况来判断淋巴结转移,结果显示,45例(75.0%)患者有淋巴结转移,较病理学检查结果新增11例,差异具有统计学意义(χ2=4.483,P=0.034)。阳性淋巴结总数为436个(55.8%),较病理学检查结果新增80个,差异具有统计学意义(χ2=16.371,P<0.001)。
2.2 E-Cadherin表达与结直肠癌临床病理参数的关系 E-Cadherin在癌组织中的表达阳性率显著低于癌旁组织(P<0.05)。E-Cadherin低表达与结直肠癌Dukes分期、浆膜浸润、淋巴结转移、肝脏转移呈正相关(P<0.05)。
2.3 11例检出淋巴结微转移患者癌组织中6例E-Cadherin表达阴性,而15例未检出微转移癌组织中仅有1例表达阴性,两者差异有统计学意义(χ2=4.160,P=0.041)。
3 讨论
E-Cadherin又称细胞-细胞粘附分子,广泛分布于各类上皮细胞间介导同型细胞间连接的、具有钙依赖性的粘附分子,其在胚胎发育、形态发生、上皮极性和完整性等方面起到重要作用[5]。其表达程度及功能活性状态直接影响细胞的脱落和再粘着,对维持组织结构的完整性、极性及细胞分化等起重要作用[6]。其表达下降时细胞的粘附作用减弱,使肿瘤细胞发生浸润和转移[7]。
本研究表明,E-Cadherin在高分化型结直肠癌的表达明显高于未分化型的结直肠癌,提示E-Cadherin与肿瘤的分化有关,可作为分子标记物来鉴别肿瘤的恶性程度。本组资料显示E-Cadherin的异常表达与结直肠癌的病理组织类型无明显相关性,主要考虑与各型腺癌结构的分化和异型程度不一致造成,例如管状腺癌就包括高、中、低分化三种类型。
多数学者认为E-Cadherin是肿瘤浸润抑制基因[8,9]。文献报道,结直肠癌E-Cadherin表达异常与肿瘤分化及浸润深度密切相关,与本研究发现一致。可见E-Cadherin可以作为大肠癌的标志物,协助判断大肠癌的预后。
研究证明,淋巴结微转移与患者预后直接相关。CK20是一种独特的I型细胞角蛋白,为具有严格的上皮特异性的癌细胞标志物,可稳定地存在于几乎所有的胃肠道癌及其转移癌中,正常血液及淋巴结的固有成分如淋巴细胞、内皮细胞一般不表达,是检测直肠癌微转移较特异的指标[10,11]。我们应用RT-PCR检测CK-20阳性率为(55.8%),而传统病理切片诊断为淋巴结转移的阳性率为(45.5%),两组间有显著性差异(P<0.001)。
11例检出淋巴结微转移患者癌组织中6例(54.5%)E-Cadherin表达阴性,而15例未检出微转移癌组织中仅有1例(6.67%)表达阴性,两者差异有统计学意义(P=0.041)。本研究提示E-Cadherin的表达减弱或消失参与了结直肠癌淋巴结微转移的发生。
参考文献
[1] Maurer CA,Graber Hu,Friess H,et al.Reduced expression of the metastasis suppressor gene KAI1 in advanced colon cancer and its metastases.Surgery,1999,126(5):869-880.
[2] Oberg A,Stenling R,Tavelin B,et al,Are lymph node micrometastasis of any clinical significance in Dukes stages A and B colorectal cancer ......
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