PCR技术在丙型肝炎病毒RNA聚合酶基因分析中的应用(2)
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由于丙肝患者的血中RNA滴度较低,所以本研究采用逆转录与第一轮PCR反应在同一管中进行,而且在逆转录反应完成后,先以低退火温度反应5个循环,第一轮PCR完成后,以其产物为模板,用内引物进行巢式扩增,巢式PCR反应的敏感性比第一轮PCR反应高10倍左右。在第一轮PCR中先进行42℃退火5个循环,可有效地提高扩增效果。在HCV-RNA阳性血清中可能存在RNA复制的中间体-负链RNA,将逆转录与第一轮PCR在同一管中进行,由于同时加入正反向引物,逆转录反应可同时双向进行,使cDNA模板量增加,增强了扩增效果。此外,逆转录与第一轮PCR反应在同一管中进行,也减少了由于反复加样操作污染的可能性。
3.2 核苷酸与氨基酸序列比较
HCV为一高度变异的RNA病毒,不同的分离株其核苷酸和氨基酸序列不同。本实验克隆的NS5B片段,其核苷酸和氨基酸与HCV-Ⅱ型同源性最高,与Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型同源性较低,表明本研究的分离株属于HCV-Ⅱ型。本研究的分离株与HCV-CH来源于同一地区,同为HCV-Ⅱ型,在一定程度上说明本地区HCV流行株的类型。
HCV虽然高度变异,但某些具有重要功能的氨基酸序列则高度保守,如NS3区的丝氨酸蛋白酶活性中心和NS5B区的RNA聚合酶结构域(GDD)等序列。本研究比较了37个不同HCV分离株的NS5B基因片段的氨基酸序列,RNA聚合酶中GDD及相关序列高度保守,预示该区可能在病毒的复制中起重要作用。
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(收稿日期:2009-12-15)
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