大鼠肾缺血再灌注对Smad7表达的影响(2)
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1.3指标检测
1.3.1肾功能检测 所取血液标本1500r/min离心30min，用微量加样器吸取上清，置于EP管中，4℃保存于冰箱中。肌酐、尿素氮检测由温州医学院附属第二医院检验科协助完成。
1.3.2HE染色制备肾组织石蜡切片，经HE染色后，光镜下观察肾组织病理改变。
1.3.3免疫组织化学分析石蜡切片经免疫组化处理后，采用Image Plus Pro6.0软件分析免疫组化结果：视野里棕黄色颗粒视为阳性着色，根据着色深浅程度分级：无着色(阴性)，浅黄色(弱阳性)，棕黄色(阳性)，深棕黄色(强阳性)。
1.4统计学方法
采用SPSS12.0 for Windows软件包对实验数据进行统计学处理，数据以均数±标准差(χ±s)表示，采取方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1肾功能变化
与同一时间点假手术组比较，模型组各小组血浆BUN均显著升高(P<0.01)，见表1。同组内不同时间点间BUN的比较：在模型组中各时间点之间比较方差分析有统计学意义(F=49.77，P<0.01)。其中随再灌注时间的延长，任一时间点均较前时间点BUN明显升高，差异有统计学意义(P均<0.01)。假手术内各小组无明显差异(F=0.031，P>0.05)。与同一时间点假手术组比较，模型组各组血浆Cr均高于假手术组(P<0.01)。见表2。同组内不同时间点间血Cr的比较：模型组中各时间点之间比较方差分析具有统计学意义(F=96.748，P<0.01)。其中随再灌注时间的延长，任一时间点均较前时间点Cr明显升高，差异有统计学意义(P均<0.01)。假手术内各小组无明显差异(F=0.018，P>0.05)。
2.2肾组织形态的改变
假手术组肾小球、肾小管结构完整(封三图1)。肾IR模型组肾脏病理变化明显，多数肾小管上皮细胞肿胀，出现水样变性，部分凝固性坏死、脱落，刷状缘消失，肾小管腔内可见管型，肾间质血管高度扩张充血，可见灶性出血区和灶性炎细胞浸润，但肾小球病变不明显(封三图2~6)。
2.3各组肾组织中Smad7表达情况
在0h时肾脏Smad7阳性表达两组表达无差异(P>0.05)。见表3。模型组肾脏Smad7阳性表达较假手术组在4h、12h、24h均减少(P均<0.01)。模型组中各时间点之间比较方差分析具有统计学意义(F=126.150，P<0.01)，其中再灌注0h组Smad7表达的平均光密度较其他各组明显多，差异有统计学意义(P<0.01)。24h组较4h、12h的平均光密度较大(P<0.01)，4h和12h组平均光密度无统计学差异(P>0.05)。见封三图7~10。
3讨论
近年来，国内外许多学者研究发现，在各种原因引起的肾功能衰竭中，TGF-β不仅可以抑制小管细胞的增殖并诱导其凋亡，还可诱导小管细胞转分化为肌成纤维细胞(MyoF)[2，3]。与配体结合后，TGF-β家族受体激活了一个由Smad蛋白家族介导的独特的信号转导通路，Smad7是TGF-β/Smads蛋白信号通路中最重要的内源性抑制因子[4]。有学者在研究中发现TGF-β诱导小管细胞生长停滞、凋亡以及小管间质纤维化与其细胞内Smad7负调控作用的不足有关[5]。先前研究表明Smad7的负调控作用存在缺点，Itoh等[6]观察到缺乏配体时，Smad7主要位于细胞核内，有配体存在时，Smad7需完成核到胞质转移过程才能与受体结合，该负调控机制存在反应缓慢，而且也存在蛋白合成不足的问题，因此，有学者采用基因转移技术将外源性的Smad7基因转染到培养的肾小管细胞中，Smad7基因转移后可明显拮抗TGF-β1诱导的G1停滞，提高G2、S的细胞的分布，减低小管细胞的凋亡，可明显拮抗TGF-β1刺激小管细胞分泌FN[7]。
在肾缺血再灌注的研究中发现TGF-β1表达呈增加趋势[8]，在以往的梗阻性肾病研究中发现TGF-β1表达也逐渐增多，Smad7表达减少[9]。Smad7在TGF-β信号传导中是自身调节负反馈机制的重要因子[10]，因此Smad7无论在生理还是病理情况下对细胞内环境的稳定均具有重要作用。本实验研究结果表明在缺血再灌注后模型组肌酐、尿素氮逐渐升高，肾组织形态学变化表明肾组织损伤逐渐加重，Smad7表达逐渐减少，在再灌注24h检测到Smad7表达较再灌注12h有所升高，但肾组织损伤仍进一步加重，从而进一步说明Smad7对TGF-β/Smads蛋白信号通路负调控机制反应缓慢，在无外界因素促Smad7表达增加情况下，难以拮抗肾缺血再灌注对肾脏的进一步损伤。因此在病理状态下，寻找上调Smad7因子表达的方法，减轻缺血再灌注对肾脏的急性期及远期损伤是值得我们继续研究的崭新领域。
[参考文献]
[1] Schiffer M，Bitzer M，Roberts IS，et al. Apoptosis in podocytes induced by TGF-beta and Smad7[J]. J Clin Invest，2001，108(6)：807-816.
[2] Nowak G， Schnellmann RG. Autocrine production and TGF-beta 1-mediated effects on metabolism and viability in renal cells[J]. Am J Physiol，1996，271(3 Pt 2)：F689-697.
[3] Fan JM， Ng YY， Hill PA， et al. Transforming growth factor-beta regulates tubular epithelial-myofibroblast transdifferentiation in vitro[J]. Kidney Int，1999， 56(4)：1455-1467.
[4] Cohen MM Jr ......
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