Skp2、P27 和CyclinE在宫颈癌组织中的表达及与临床病理特征的关系(2)
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参见附件(3616KB，4页)。
1.2 实验方法
采用免疫组织化学二步法分别检测标本中Skp2、P27和CyclinE的表达，以购买的阳性片免疫组化染色结果为阳性对照。以PBS 替代第一抗体的免疫组化染色结果为阴性对照。
1.3 试剂
浓缩型鼠抗Skp2单克隆抗体、即用型P27鼠抗单克隆抗体、CyclinE鼠抗单克隆抗体、SP免疫组化染色超敏试剂盒购自福建迈新生物技术公司。
1.4实验步骤
按说明书操作，石蜡切片经过二甲苯脱蜡→梯度酒精脱水→抗原修复→柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复→过氧化物酶阻断溶液阻断内源性过氧化物酶→封闭非特异性抗原→加一抗→过夜→二抗→三抗(链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液)→DAB染色→苏木素复染→脱水、透明→封片。
1.5 结果判断
免疫组化切片在光镜下按统一放大倍数(×400倍)，以组织切片中细胞核染为棕褐色或棕黄色者为阳性细胞标志。
1.6 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件包进行统计学分析，P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 Skp2、CyclinE在ICC、CIN及NCE中的表达
Skp2、CyclinE 的阳性表达位于细胞核。在低分化ICC细胞核中呈强阳性，在CIN中呈阳性或弱阳性，在NCE中呈阴性，偶见弱阳性表达，见图1A、B、D。从NCE→CIN→ICC，Skp2和CyclinE蛋白的阳性表达率逐渐升高，见表1。ICC中Skp2和CyclinE表达与组织学分级、间质浸润、盆腔淋巴结转移和脉管浸润显著相关，两者的阳性表达率显著增高，见表2。Skp2和CyclinE蛋白阳性表达组的5年生存率明显低于其阴性表达组(P<0.05)，见图2、图4。
2.2 P27在ICC、CIN及NCE中的表达
在NCE组中P27阳性表达多数位于表层分化完毕的细胞核中，胞浆弱表达，见图1C，而在ICC组中胞核呈阳性表达，胞浆弱表达。从ICC→CIN→NCE，P27阳性表达率逐渐升高，见表1。在淋巴结转移阳性、脉管浸润阳性及间质浸润(>浅肌层)中，P27阳性表达率显著降低，见表2。P27蛋白阳性表达组的5年生存率明显高于其阴性表达组(P<0.05)。见图3。
2.3 宫颈癌中Skp2、P27及CyclinE的表达与预后的关系
根据随访资料，Skp2和CyclinE高表达、P27低表达者5年生存期明显低于Skp2和CyclinE低表达、P27高表达者，两组统计学比较有显著性差异(P<0.05)。见表3。Skp2和CyclinE表达阴性、P27表达阳性患者预后明显优于Skp2和CyclinE表达阳性、P27表达阴性者，见图2～4。
2.4 ICC中Skp2、P27及CyclinE表达的相关性
经Spearman等级相关分析发现，ICC中Skp2与P27蛋白表达呈显著负相关(r=-0.458，P<0.01)。Skp2与CyclinE蛋白表达呈显著正相关(r=0.763，P<0.01)。P27与CyclinE蛋白表达呈显著负相关(r=-0.504，P<0.01)。
3 讨论
3.1 Skp2在宫颈癌中的表达及意义
Skp2是Zhang等[1]于1995年从大量的恶变细胞中发现的一种能与S期激酶cyclinA-CDK2相互作用的蛋白，故命名为Skp2(S-phase kinase-associated proteins)。何春年[2]等研究显示：Skp2 在NCE中表达很低，在CINⅠ中表达明显增高。大量研究表明，Skp2在多种恶性实体肿瘤中常呈高表达，且提示预后不良。本研究中，我们检测到Skp2在ICC中阳性表达率为57.1%，与Dowen等研究结果相似。Skp2在ICC中的阳性表达率高于CIN及NCE，在CIN中的阳性表达率也高于NCE，表明Skp2高表达与宫颈癌密切相关，可能与Skp2泛素化降解P27，导致细胞无限制通过G1/S期转换“关卡”，无限制的分裂增殖，形成恶性克隆，最终导致肿瘤发生[3]。为进一步探讨Skp2在宫颈癌发展进程中的作用，我们分析了Skp2蛋白的表达与临床病理因素之间的关系，结果显示，Skp2的阳性表达率与临床分期、患者年龄及癌灶大小无明显关系，而与肿瘤分化程度、淋巴结转移、间质浸润深度和脉管浸润显著相关，以上提示Skp2的高表达使得肿瘤具有更强的侵袭性。另外从本研究中还发现Skp2高表达者5年生存期明显低于Skp2低表达者，且Skp2阴性表达组的预后明显优于阳性表达组，以上均提示Skp2阳性表达或高表达者，癌细胞具有更强的侵袭性，且预后差。
3.2 P27在宫颈癌中的表达及意义
P27作为细胞周期负性调控因子，广泛抑制各种细胞周期蛋白和激酶的活性，与肿瘤发生、发展及预后密切相关。在人类几乎所有的上皮性肿瘤中都有P27蛋白表达的下降或缺失，且随恶性程度的增加其表达呈下降趋势。在乳腺癌、食管癌、前列腺癌[4]等研究证实：P27蛋白的表达强度与肿瘤的组织学分级、生存期明显相关。本研究中P27蛋白在ICC→CIN→NCE的阳性表达率逐渐升高，与Skomedal等[5]在宫颈癌的研究结果相似，表明P27是宫颈癌的抑制因素，宫颈癌中P27的下调消除了对细胞周期的抑制，使细胞无限制的增殖，导致肿瘤发生。肿瘤的分化程度影响肿瘤的预后，本研究显示P27的表达随着肿瘤分化程度降低，阳性表达率逐渐下降，提示P27与肿瘤的生物学恶性行为有关。同时本研究结果显示，P27的阳性表达率与临床分期、患者年龄及肿瘤大小无明显关系，而与淋巴结转移、间质浸润深度和脉管浸润显著相关，其阳性表达率显著下降，可能与P27的下调降低细胞间的粘附能力，使肿瘤易于发生转移。另外从本研究中还发现P27低表达者5年生存期明显低于P27高表达者，并且P27阳性表达组预后明显优于阴性表达组，以上提示P27低表达或表达缺失与肿瘤的发生、恶性进展相关，并提示预后不良。
3.3 CyclinE在宫颈癌中的表达及意义
CyclinE是细胞周期G1期的正性调控因子，其过表达可促进细胞由Gl期进入S期，使正常细胞增殖失控导致肿瘤的发生，已被证实是一种癌基因。有学者在乳腺癌，胃癌[6]中均发现CyclinE基因的扩增出现在细胞癌变的早期。本研究中我们发现CyclinE在宫颈癌中的阳性表达率明显高于CIN及NCE，在CIN中的阳性表达率也高于NCE，由此推断CyclinE过表达参与ICC的发生及恶性进展 ......
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