2-甲氧基雌二醇对全脑缺血大鼠HIF-1α及RTP801的作用研究(2)
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1.3 2-甲氧基雌二醇干预
全脑缺血2-甲氧基雌二醇干预组中大鼠，2-甲氧基雌二醇腹腔注射应用于松开双侧颈总动脉夹后(用量16 mg/kg)，6 h、12 h及24 h亚组大鼠应用2-甲氧基雌二醇1次，48 h组在第2天应用1次同样剂量，72 h、7 d组在第3天和第7天分别各应用1次同样剂量。GI组应用等量生理盐水腹腔注射，假手术组不给予干预措施。2-甲氧基雌二醇购于Sigma公司。
1.4 Nissl染色
将冰冻切片室温放置30 min，放入4 ℃丙酮固定10 min；置于50～60 ℃温箱内、1%甲苯胺蓝水溶液中40 min；蒸馏水洗涤；95%乙醇分化；脱水及透明后封片。
1.5 HIF-1α蛋白表达的检测
应用免疫组织化学S-P法检测HIF-1α蛋白的表达，DAB显色，具体操作步骤按照试剂说明。HIF-1α多克隆一抗由武汉博士德公司提供。应用PBS代替一抗做阴性对照。
1.6 RTP801 mRNA表达的检测
采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)法检测。Trizol提取RNA、反转录及PCR的实际步骤依照试剂盒说明。RTP801引物及β-actin由Invitrogen公司(美国)提供，cDNA合成试剂盒、Trizol试剂盒和PCR扩增试剂盒均由生工生物工程(上海)有限公司供应。
1.7 统计学处理
在高倍镜下，于每张切片海马的CA1区随机选择5个视野进行神经元密度(神经元数/高倍镜视野)及HIF-1α阳性细胞计数，数据以(χ±s)的形式表示，数据采用SPSS 13.0软件包进行统计分析，全脑缺血组及全脑缺血2-甲氧基雌二醇干预组中各亚组与假手术组间比较采用方差分析，全脑缺血组及全脑缺血2-甲氧基雌二醇干预组相应时间点间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 全脑缺血大鼠模型制作
在夹闭大鼠双侧颈总动脉后2～3 min内，脑电图显示为一直线表明模型制作成功。夹闭大鼠双侧颈总动脉10 min，将双侧动脉夹同时取下，可见大鼠脑电波有部分程度的恢复，但脑电图的频率以及波幅均低于颈总动脉夹闭之前。
2.2 Nissl染色以及神经元计数
假手术组中大鼠海马的CA1区为3～5层，神经元形态清晰、数目多，染色比较均匀。GI组大鼠海马CA1区细胞数减少，并且可见神经细胞肿胀、变形、溶解并形成空泡。GI+2ME2组48 h、72 h、7 d亚组与GI组相应亚组对比海马CA1区细胞计数增加，差异有统计学意义(t分别为4.59、4.58、8.86，P<0.05)，同时细胞损伤减轻，形态较规则，边缘较清晰，轴突形态较好。染色神经元细胞数见表1(个/高倍视野，×400)。
2.3 HIF-1α蛋白表达的免疫组化检测
镜下以棕黄色细颗粒为HIF-1α蛋白阳性信号。在假手术组中蛋白阳性信号极其少见。而GI组的蛋白阳性信号于缺血后6 h逐渐增加，在缺血后72 h达最高水平，7 d后基本到达正常。GI+2ME2组48 h、72 h、7 d亚组大鼠海马CA1区HIF-1α较GI组相应亚组蛋白阳性信号低，差异有统计学意义(t分别为5.14、6.07、10.40，P<0.05)。阳性表达的细胞数见表2(个/高倍视野，×400)。
2.4 RTP801 mRNA表达的RT-PCR检测
RTP801 mRNA在假手术组大鼠中未见表达，而缺血6 h后可见GI组大鼠RTP801 mRNA表达增加，先随着时间的延长而升高，24h后随着时间的延长而降低，7d后下降至正常水平。GI+2ME2组12 h、24 h、48 h、72 h亚组较GI组相应亚组RTP801 mRNA表达减少，差异有统计学意义(t分别为4.59、7.07、4.79、4.71，P<0.05)。RTP801吸光度比值见表3。
3 讨论
2-甲氧基雌二醇是雌激素的正常代谢产物，存在于人体的血液与尿液中，可在转录后水平抑制HIF-1α[4]。HIF-1是由α、β两个亚基形成的异二聚体核转录因子，能够被低氧状态所激活[5]。HIF-1α属于氧敏感亚基，HIF-1稳定性主要由α亚基控制，HIF-1β在细胞中稳定表达。HIF-1参与调控下游一系列靶基因表达，目前发现由HIF-1直接启动的基因有60余个，其中包括一些HIF-1依赖的凋亡相关基因[1，2，5，6]以及对缺氧适应性的基因，在脑缺血过程中HIF-1α相关促凋亡基因主要有p53、bcl-2家族某些成员(如其中bcl-Xs、bax等)、caspase(caspase 3、caspase 8、caspase 9)、RTP801、HGTD-P等。此类基因的表达可促进细胞的凋亡。我们的实验结果表明，2ME2可抑制HIF-1α的过度表达，从而抑制靶基因的表达，具有神经保护作用[6]。Helton R等[7]研究发现，将HIF-1α基因敲除后，HIF-1α在脑缺血缺氧小鼠中表达缺失，凋亡相关的基因表达减少，表明HIF-1α表达缺失在脑缺血的过程中具有一定神经保护作用，从而推测HIF-1α过度表达在脑缺血缺氧中是有害的。
RTP801是HIF-1α依赖的凋亡相关基因。RTP801是Shoshani T等[8]首次发现的，在脑缺血动物模型及细胞培养中均发现其表达明显上调，在大脑中动脉闭塞大鼠模型缺血半暗带以及坏死区应用原位杂交技术均检测到RTP801，脑缺血缺氧过程中RTP801表达升高见于0.5～2.0 h内，持续至少3 d，RTP801对缺氧反应动态的变化与已知的其他如VEGF等HIF-1靶基因类似，这提示了RTP801可能也是HIF-1依赖基因之一。实验显示，正常ES细胞中，在缺氧条件下RTP801 mRNA的表达可被强烈诱导，而在HIF-1α-/- ES细胞内同样缺氧条件下却没有检测到其表达，因此推测，HIF-1α调控缺氧条件下RTP801表达。RTP801表达作用可表现为促进凋亡或抗凋亡两方面。应用质粒将RTP801 cDNA转移至小鼠肺细胞中，这可导致大量细胞的死亡。在MCF7和PC12细胞中导入四环素选择的启动子后可促进RTP801的表达 ......
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