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编号:12176541
重组人促红细胞生成素对大鼠急性创伤性脑损伤脑组织中基质金属蛋白酶-9及水通道蛋白-4表达的影响(2)
http://www.100md.com 2012年1月25日 周鹏 郝解贺
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    参见附件。

     1.2.1 脑创伤模型制作 采用改进Feeney法自由落体硬膜外撞击方法造致伤模型。大鼠称重后,10%水合氯醛(35 mg/kg)腹腔注射麻醉,头部固定于立体定向仪上,无菌条件下暴露右顶骨,于矢状缝中线旁开2.5 mm、冠状缝后1.5 mm处,牙科台式电钻钻孔扩大成直径5.0 mm的类圆形骨窗,保持硬脑膜完整,放置撞击圆锥,将40 g砝码置于15 cm高处呈自由落体撞击,造成局灶性中度脑挫裂伤,切口处消毒,缝合头皮。假手术组仅切开头皮,开骨窗,不造成脑损伤。动物模型制作成功后,EPO治疗组立即腹腔注射人重组EPO 5000 U/kg,假手术组和对照组均腹腔注射等量的生理盐水。术毕各组动物头部消毒后放回笼内饲养,正常喂食水。

    1.2.2 神经行为评定 大鼠颅脑损伤后行神经功能评分(neurological severity score,NSS)[4]。运动测试6分,感觉测试2分,直杠平衡测试6分,反射缺失或者异常活动4分,最高分数18分,最低分数0分。将术后评分为7~12分的老鼠纳入中度创伤性脑损伤模型,否则弃之不用。

    1.2.3 制备石蜡切片和HE染色 各组在相应时间点以10%水合氯醛(0.5 mL/kg)麻醉大鼠后,剪开胸腔暴露心脏,先用37 ℃生理盐水200 mL经心脏灌注,同时剪开右心耳,再用4%多聚甲醛200 mL灌注固定后断头取脑,经10%中性甲醛固定24 h后,常规梯度乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋脑组织标本。大鼠脑组织标本冠状面连续切片,厚度5 μm,HE染色方法严格按说明书染色步骤进行,光镜下观察细胞、组织排列及变化并照相。

    1.2.4 MMP-9和AQP-4测定 采用抗生物素-生物素-过氧化物酶复合法(SABC)检测MMP-9和AQP-4的阳性表达。MMP-9和AQP-4兔抗鼠抗体(一抗)其工作效价1︰200;切片常规脱蜡,过氧化氢封闭,微波抗原修复20 min,血清封闭,分别滴加兔抗鼠MMP-9和AQP-4一抗,室温孵育60 min。0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)洗5 min、3次,然后滴加山羊抗兔IgG抗体-HRP多聚体(二抗),室温孵育20 min,PBS洗5 min、3次,DAB溶液显色,镜下控制反应时间,自来水终止反应,脱水、透明、封片,显微镜观察。免疫组化染色的切片行光镜检查,观察其染色强度,MMP-9和AQP-4阳性细胞表现为细胞浆呈棕色。在多功能显微镜下随机选取5个200×不重复视野进行照相,图像资料使用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统测定每个视野阳性染色区域的细胞数。

    1.3 统计学处理

    采用SPSS13.0统计软件包进行统计分析,实验数据用(x±s)表示,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析及组间两两比较,方差不齐者采用非参数Kruskal Wallis检验,P < 0.05表明差异有统计学意义。

    2 结果

    2.1 神经行为评定

    大鼠在颅脑损伤后立即出现前肢抱握屈曲、后肢强直、肌张力增高、不能直走、向一侧打转等表现。清醒后精神萎靡不振,活动减少。术后神经功能评分均在7~12分之间。

    2.2 组织学观察

    光镜下见假手术组皮层神经细胞呈圆形或椭圆型,核膜完整,核仁清晰可见呈蓝色淡染,周围神经纤维致密,着色均匀。伤后6 h组可见神经元细胞肿胀,体积增大,核膜不清,核仁深染偏位或消失(图1)。48 h组神经细胞周围可见空隙,胞质强烈嗜伊红,核固缩。胞质与胞核黏附在一起,称为暗细胞,且数量增多,72 h组神经胶质细胞和组织间隙水肿明显,大量的多型核白细胞和单核巨噬细胞积聚在水肿带。神经元胞质呈严重缺血性改变。7 d组暗细胞数量减少。假手术组无明显变化。

    2.3 脑组织中MMP-9和AQP-4的表达

    免疫组化染色结果显示MMP-9随着损伤时间的延长其表达明显增强,48 h达高峰,以后逐渐下降,7 d时下降到最低(图2),在假手术组几乎不表达,EPO治疗组各时间点表达明显少于对照组(P<0.05),见表1。AQP-4在损伤后,表达水平迅速升高,24 h达最高水平,48 h后开始下降,至7 d时仍高于正常水平(图3),假手术组各时间点无变化,EPO治疗组各时间点表达明显少于对照组(P<0.05)。见表1。

    3 讨论

    目前对于急性创伤性脑损伤尚缺乏完善的治疗方法,治疗的关键还是控制继发性脑损害的发展。近年来研究表明,EPO在脑外伤中可通过[3]抗凋亡、抗氧化、减轻脑水肿、促进神经细胞再生、减少兴奋性氨基酸神经毒性、抗炎症[5]和促进血管生成方面[6]等途径对继发性脑损害的发展发挥重要作用。本实验主要通过研究EPO对大鼠急性创伤性脑损伤的保护作用,为临床治疗急性创伤性脑损伤奠定理论基础。

    MMP-9是MMPs中的重要明胶酶,在血管再生、炎性反应、血脑屏障(BBB)的破坏中起重要作用,正常脑组织中MMP-9表达水平极低[7,8]。在脑创伤后,神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞、内皮细胞和侵入的中性粒细胞均可大量表达。

    AQP-4是促进水转运跨膜蛋白家族中的重要一员,是脑内最主要的水通道蛋白,在大脑皮层呈低表达,主要在星形胶质细胞及室管膜细胞亚群中表达[9],大鼠外伤性脑损伤损伤后诱发了血脑屏障的胶质细胞胞膜AQP4的表达,促进了体液能够迅速通过毛细血管渗入神经组织间隙是导致脑水肿的病理机制之一[10]。

    本实验发现,大鼠脑损伤后,大脑皮层中的MMP-9和AQP-4的含量明显增高,在不同的时间点含量不同,MMP-9在1~2 d达到高峰,3 d后开始逐渐降低。AQP-4在24 h达到高峰,3 d后开始降低。EPO治疗组MMP-9和AQP-4含量均低于对照组,提示EPO有抑制MMP-9和AQP-4表达的作用。这说明急性创伤性脑损伤的发展过程与MMP-9和AQP-4的表达密切相关。也证实了EPO可通过降低脑损伤后血清MMP-9和AQP-4含量,来抑制颅脑损伤后炎症反应的发生和脑水肿的发展,从而发挥神经保护作用。

    EPO的主要作用是促进红细胞生成,长期、反复、大量的用药将会导致血液黏稠、静脉血栓、中风的发生。最近Erbayraktar等[11]报道已经研制出了缺乏唾液酸基的EPO,它无生成红细胞的功能,半衰期短 ......

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