淋病奈瑟菌表面蛋白A克隆、表达和免疫原性鉴定(2)
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参见附件。
1.4 nspA基因原核表达系统的构建
采用小量碱变性法提取测序结果有正确插入序列的重组质粒pMD18-TnspA，BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切重组质粒pMD18-TnspA，获得的目的基因片段，按5∶1比例将获得的目的基因片段nspA和线性化的表达载体pET42a混合，用T4连接酶连接，连接产物转化于表达宿主菌E.coli BL21中形成目的基因表达系统E.coli BL21pET42a-nspA，提取重组质粒双酶切后再次测序。
1.5 目的重组蛋白rNspA的表达和纯化
测序结果正确的E.coli BL21pET42a-nspA在含50 μg/mL卡那抗性的LB培养液中37℃振荡培养4 h后，加入诱导剂IPTG使终浓度为1.0 mmol/L，37℃继续振荡培养4 h。采用SDS-PAGE联合Bio-Rad凝胶图像分析系统测定rNspA表达量，采用Ni-NTA亲和层析法提纯表达的目的蛋白rNspA，紫外线分光光度法测定蛋白浓度。
1.6 重组蛋白rNspA免疫原性分析
将2 mg rNspA与弗氏佐剂混合，每次间隔1周皮内多点免疫家兔3次，末次免疫后10 d心脏采血后分离血清，采用免疫扩散试验检测其效价。Western Blot检测rNspA的免疫原，10%SDS-PAGE鉴定重组蛋白rNspA并电转至PVDF膜，rNsp的兔抗血清1︰500稀释后为一抗，辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(Jackson Immuno Research)1∶3000稀释后为二抗。
2 结果
2.1 nspA基因扩增、克隆和测序结果
PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，525 bp处有nspA基因扩增片段。T-A克隆重组质粒pMD18-TnspA和亚克隆重组质粒pET42anspA经BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切后可获得预期的酶切图谱(图1)。克隆和亚克隆重组质粒测序结果nspA基因核苷酸和氨基酸序列与GenBank中登录的相应序列(AY157539.1)完全相同。
2.2 rNspA的表达和提纯效果
SDS-PAGE结果显示，目的重组融合蛋白rNspA表达量最高，可达细菌总蛋白的40.1%，Ni-NTA亲和层析法提纯后rNspA显示为单一的蛋白条带(图2)。
2.3 目的重组蛋白免疫原性检测结果
rNspA兔抗血清免疫双扩效价为1∶4。Western blot结果表明，rNspA兔抗血清能有效识别rNspA并与之结合(图2)。
3 讨论
人类是淋病奈瑟菌唯一的自然宿主，主要通过性接触传播，淋病奈瑟菌引起的淋病是我国最常见性病之一。淋病奈瑟菌侵袭患者泌尿生殖系统，感染后出现尿道炎和宫颈炎以及附睾炎、盆腔炎等并发症，女性患者还可由于并发症造成不育、宫外孕等严重后果[4-6]。解放前我国淋病流行十分严重，经综合治理到二十世纪六十年代中期，淋病在我国已基本消灭，但八十年代后随着改革开放淋病又重新传入我国，到了二十世纪末，淋病发病率位居我国性病之首，随着抗生素广泛应用，2000年后淋病的发病率虽有下降，但总体数量仍然庞大，淋病感染不容忽视[5，6]。根据中国疾病预防控制中心公布的甲、乙类传染病统计数据，2009年和2010年我国淋病患者数分别为105 544人和119 824人。且由于临床药物使用混乱、剂量不足、疗程不规范及部分患者在无任何指征情况下自行随意用药等，导致淋病奈瑟菌的耐药性日趋增强，给淋病治疗带来了困难[4]。淋病发病率高和淋病奈瑟菌耐药性强是摆在世界各国卫生部门亟待解决的难题。各国都在寻找淋病新的治疗和预防方法，疫苗成为研究的热点。目前研究较多的候选疫苗，如Por、Pil、Opa、Los等[3]。但研究发现上述候选疫苗的抗原都存在不同程度的变异容易产生免疫逃逸。文献报道淋病奈瑟菌nspA基因编码的NspA氨基酸序列同源性高达98%，与脑膜炎奈瑟菌的同源性也达93%，说明该序列非常保守，是一个很好的疫苗候选者[3]。
我们根据GenBank公布的淋病奈瑟菌WHO-A株nspA基因序列设计引物并进行克隆、表达，构建的原核表达系统E.coli BL21pET42a-nspA在37℃ 1.0 mmol/L的IPTG诱导下重组蛋白rNspA表达量可达细菌总蛋白量40.1%，即使在较低浓度的诱导剂(0.1 mmol/L的IPTG)作用下rNspA的量可达细菌总蛋白量的35%以上，并且主要以包涵体形式存在，这有利于产业化。Western bolt结果证实，rNspA兔抗血清与rNspA结合能有效识别，说明rNspA具有被抗体识别的抗原决定簇，具有良好的免疫反应性。免疫双扩效价为1∶4，说明rNspA免疫家兔后能产生高效价抗体，具有良好的抗原性。
综上所述，我们已成功建立了rNspA高效表达系统，所表达的rNspA有良好的免疫原性，可作为基因工程疫苗的候选抗原。
[参考文献]
[1] Sun AH， Fan XL， Gu Y， et al. Predominant porB1A and porb1B genotypes and correlateion of gene mutations with drug resistance in Neisseria gonorrhoeae isolates in Eastern China[J] ......
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