IGF—ⅠR信号通路在西妥昔单抗抗HepG2细胞增殖中的作用(2)
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参见附件。
1 材料与方法
1.1 药品与试剂
西妥昔单抗、IGF—ⅠR抑制剂aIR3与IGF均购自德国默克制药公司，CCK—8细胞计数试剂盒产自日本同仁化学研究所，RPMI—1640细胞培养液、10%新生小牛血清、含100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的双抗、0.25%胰酶溶液购自美国Gibco公司，分析纯二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司。
1.2 细胞培养
人肝癌细胞株HepG2购自中科院上海细胞所，细胞培养液为含10%小牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI—1640培养液，培养于37℃、5%CO2、85%湿度的培养箱，每3～4天传代1次，细胞于对数生长期时开始实验。
1.3 细胞生长抑制实验
分为5组，包括空白对照组、细胞对照组、西妥昔单抗组、IGF和西妥昔单抗联合组、aIR3和西妥昔单抗联合组，每组设3个复孔。HepG2细胞用0.25%胰酶溶液消化，用RPMI—1640培养液稀释并接种于96孔培养板，使其密度为3×104/mL，置于恒温箱中培养。西妥昔单抗单用时选取7个依次递增的浓度[(5～500)mg/mL]处理细胞，两药联用时，按照药物联合作用实验原则，加入孔内的药物浓度亦同时递增，且两药间浓度比例保持恒定[西妥昔单抗(5～500)mg/mL，IGF(2.5～250)μmol/L，aIR3(2.5～250)μmol/L]。分别培养24 h、48 h、72 h，应用全自动酶标仪测定各孔吸光度值(A值)，并计算细胞增殖抑制率。
1.4 统计学方法
计算各组细胞增殖抑制率均数，以均数±标准差(x±s)表示，采用双侧t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 西妥昔单抗单药或联合aIR3对HepG2细胞增殖的影响
西妥昔单抗单药或联合aIR3与HepG2细胞培养72 h后，单药与联合组的增殖抑制率均随剂量增加而升高，但在相应浓度下，西妥昔单抗联合aIR3组增殖抑制率均显著高于同浓度的西妥昔单抗组(均为P < 0.01)，见表1、图1，提示aIR3可协同西妥昔单抗对HepG2细胞的增殖抑制作用。
2.2 西妥昔单抗单药或联合IGF对HepG2细胞增殖的影响
西妥昔单抗单药或联合IGF与HepG2细胞培养72 h后，西妥昔单抗单药组的增殖抑制率随剂量增加而升高，二药联合组增殖抑制率无显著变化。IGF在(10～250)μmol/L浓度范围内，西妥昔单抗在(20～500)mg/mL浓度范围内，两药联合组增殖抑制率均显著低于相应浓度的西妥昔单抗组(均为P < 0.01)，见表2、图2，表明IGF可拮抗西妥昔单抗对HepG2细胞的增殖抑制作用。
3 讨论
近年来，分子靶向治疗技术的飞速发展为肝癌提供了一个新的治疗途径，随着国内外研究的不断深入，涌现出了许多针对不同细胞表面分子的新型靶向治疗药物，而EGFR抑制剂则是最受关注的领域之一。EGFR属受体酪氨酸激酶(tyrosine kinase，TK)erbB/HER家族。它含有3个结构域：胞外受体结合区、跨膜区及含酪氨酸激酶结构域的胞内区。受体结合相应配体后发生二聚化，使细胞内酪氨酸残基发生磷酸化，进而募集并活化信号复合体，激活其下游信号转导蛋白。对肿瘤细胞的生物学作用包括调节侵袭、转移、血管生成、生长及转化。EGFR高表达见于多种恶性肿瘤，且EGFR高表达的恶性肿瘤患者预后不良[4]。肝癌细胞中也常有EGFR的表达，并与肝癌患者的临床分期、肝内外转移及组织分化程度等有关[5]。
目前已成功开发出可用于临床治疗的两类EGFR抑制剂，包括小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)与单克隆抗体(mAb)[6]。mAb通过竞争性地与相应配体结合，阻止该配体与受体结合，从而抑制后者酪氨酸激酶的激活与下游信号通路的活化。TKI与EGFR结合后，可阻断ATP与TK结构域的结合，使其受体无法磷酸化，信号传导通路中断，但不引起EGFR内化[7]。大量临床前研究及临床资料证实，EGFR抑制剂能够有效抑制肿瘤增殖。但EGFR抑制剂在临床应用中已出现了耐药现象，其产生耐药的机制仍未完全明确，其中绕开EGFR通路的其他TK受体的活化被认为是产生耐药性的重要机制，而IGF—ⅠR通路则是一条重要旁路[3，7]。
胰岛素样生长因子Ⅰ型受体(IGF—ⅠR)在多种细胞广泛表达，对调节正常细胞的多种生物学功能起关键作用。但其过度表达可使细胞向恶性转化，已见于多种恶性肿瘤。IGF—ⅠR介导的信号通路在促有丝分裂活性、细胞恶性转化外、抗细胞凋亡等方面有重要作用。IGF—ⅠR单克隆抗体aIR3对肿瘤的抑制作用已有不少报道[8]。aIR3可通过阻滞细胞于G0/G1期、诱导细胞凋亡等作用抑制肝癌细胞增殖。此外，aIR3除可抑制IGF—ⅠR功能及其下游丝氨酸/苏氨酸Akt的磷酸化，还可通过溶酶体依赖与非依赖途径降解IGF—ⅠR[9]。aIR3封闭IGF—ⅠR，在体外可消除IGF—ⅠR促增殖、抑制凋亡的作用 ......
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