三种miRNA血清水平与非小细胞肺癌的相关性研究(2)
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1.3.3 荧光定量PCR 总反应体系为20μL：2×SYBR Green荧光定量预混液10 μL，上述扩增的cDNA(1∶20稀释)2 μL，去核酸酶水7.0 μL，引物1 μL。通过Roche Light Cyeler 480实时荧光定量PCR系统进行检测。反应参数：95℃，1 min；95℃，15 s；60℃，45 s共40个循环。
1.4 统计学方法
3种miRNA表达结果以miR—22的表达水平为内参，随机以其中一个血清样品为阳性对照。利用SPSS 13.0统计学软件对实时荧光定量PCR检测的相对表达量进行分析，表达量的相对比值以均数±标准差(x±s)表示，采用t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
NSCLC患者与健康人群的血清RNA进行逆转录扩增后，行荧光定量PCR检测各miRNA的表达量，以miR—22为内参计算其相对比值。let—7、miR—125b—1表达量在NSCLC患者血清中均低于对照组，miR—21表达量显著高于对照组(均为P < 0.01)，见表1。其与健康对照者血清的比值平均为21.1%、13.5%、207.4%，见图1。提示let—7、miR—125b—1、miR—21的表达水平可能成为NSCLC患者的血清标记物。
表1 三种miRNA在NSCLC患者与健康人群血清表达量(x±s)
图1 三种miRNA在NSCLC患者与健康人群血清中的表达
3 讨论
肿瘤的早期发现与治疗是降低其死亡率的关键。但多数肿瘤缺乏高度敏感和特异的标记物[4]，因此寻找肿瘤早期发生的标记物一直是肿瘤学研究的热点。外周血肿瘤标记物的检测具有几乎无创、可进行重复多次测定的优点，是肿瘤诊断的较理想手段。研究发现，外周血miRNA的表达具有肿瘤相关性与组织特异性的特点[5]。miRNA对外周血核糖核酸酶稳定，因此较RNA更为稳定，甚至在室温下过夜、反复冻存—解冻、煮沸、过酸或过碱等条件下仍能稳定表达[6]。故外周血miRNA可能是较理想的肿瘤标记物。
let—7是研究最多的与肺癌密切相关的miRNA。超过60%的肺癌组织与80%的肺癌细胞株中let—7的表达水平显著降低[7]，并且let—7低表达的肺癌患者预后不良。国外研究发现，let—7在胚胎末期表达上调，在肿瘤早期表达降低[8]，且表达减少在NSCLC更为常见。Scott等发现let—7低表达是相对早期癌症的标识[1]。流行病学调查发现，let—7在KRAS 3′端非翻译区的基因突变与NSCLC的好发有关[9]。我们的研究发现，let—7在NSCLC患者外周血的水平仅为正常健康人群的21.1%，提示外周血let—7可能是一种较好的与NSCLC有关的肿瘤标记物。
miR—125b—1与肺癌的发生相关。此miRNA定位于11q23—24杂合型缺失的微小区域，后者在肺部、乳腺和卵巢肿瘤中存在突变或缺失。miRNA基因的突变或缺失可影响其表达水平。国内研究发现，miR—125b—1在癌旁正常肺组织中无异常，在肺癌组织中存在基因突变，且miR—125b—1基因突变与癌的淋巴结转移及临床分期呈显著正相关[10]。在本研究中，外周血miR—125b—1在肺癌患者中显著降低，仅为健康人群的13.5%，提示miR—125b—1与肺癌的发生高度相关。
miR—21在多种肿瘤细胞中表达异常。在大多数肿瘤中，如恶性胶质瘤、肺癌、乳腺癌、胆道癌、胰腺癌、直肠癌、膀胱癌及食管癌细胞或组织中，miR—21的表达均显著升高。但在少数肿瘤，如卵巢癌、促肾上腺皮质素分泌型垂体瘤等中表达明显降低。研究发现，通过miR—21区分胆管癌与正常组织的灵敏度可达95%，提示miR—21可用于胆管癌的诊断[11]。通过计算miR—21与miR—205的表达量比值，可对侵袭性与非侵袭性的膀胱癌细胞进行有效的判别，其临床灵敏度和特异性可分别达到100%和78%。在本研究中，NSCLC患者外周血miR—21大幅升高，提示其与肺癌的发生密切相关。但由于miR—21在多种肿瘤中高表达，其在外周血的表达水平与其他肿瘤的相关性尚需进一步研究。
[参考文献]
[1] Shell S，Park SM，Radjabi AR，et al. Let—7 expression defines two differentiation stages of cancer[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2007，104(27)：11400—11405.
[2] 任为正，叶鸿飞，赵健，等. MicroRNA let—7与肺癌关系的研究进展[J]. 中国肿瘤生物治疗杂志，2009，16(4)：418—421.
[3] 龚柳阳，吴小脉，冯加喜. 肺癌相关microRNA的研究进展[J]. 中国肺癌杂志，2009，12(9)：1032—1035.
[4] Rifai N，Gillette MA，Carr SA. Protein biomarker discovery and validation： the long and uncertain path to clinical utility[J]. Nat Biotechnol，2006，24(8)：971—983.
[5] Cho WC. OncomiRs： the discovery and progress of microRNAs in cancers[J]. Mol Cancer，2007，6：60.
[6] Mitchell PS ......
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