miR—218下调与宫颈癌发生相关性的初步研究(2)
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参见附件。
1 材料与方法
1.1 实验材料
Trizol试剂，M—MuLV First Stand cDNA Synthesis Kit，Ready—To—Use PCR Kit，Hot Start Fluorescent PCR Core Kit等购于BBI公司。
1.2 标本采集
选取2009年3月～2010年9月在我院接受宫颈锥切术112例，其中25例正常宫颈组织、35例宫颈上皮内瘤样病变和52例宫颈癌组织。患者平均年龄38岁(32～65岁)，无其他疾病。参与本研究的患者均已签署知情同意书。将收集到的组织在20 min内冻存于—80℃中。
1.3 miR—218的相对表达量的测定
用Primer premer5.0软件设计引物后交上海生物工程公司合成。引物序列为：β—actin正义链：5′GATGAGACTCTAGACTCATG 3′，反义链：5′GCTCTACACTATCGAGCAT3′；miR—218正义链：5′GGAGTGGCGAATGGTAGTGGAGT3′，反义链：5′ACCAGGCTGGACAGTAGAGCG3′。Trizol法提取总RNA，合成cDNA后测定引物特异性，实时荧光定量PCR法测定各目的基因mRNA的表达量。
1.4 统计学处理
采用SPSS 17.0软件包进行统计学处理，其中计量数据以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用方差分析、t检验或Dunnett—t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
三种宫颈组织中miR—218的相对表达量实时荧光定量PCR扩增曲线平滑，各基因均有明显的指数扩增期，溶解曲线单一，无非特异性扩增(图1、2)。设正常宫颈组织miR—218表达量为1，宫颈上皮内瘤变和宫颈癌组织与之比较其相对表达量(图3)。结果显示与正常宫颈组织相比，宫颈上皮内瘤变组织和宫颈癌组织的miR—218表达量均下降，差异有统计学意义(P < 0.05)。与宫颈上皮内瘤变组织相比，宫颈癌组织的miR—218表达量下降，差异有统计学意义(P < 0.05)。
宫颈癌组织miR—218的表达与临床病理特征的联系：不同的病理分级、间质浸润深度、淋巴结转移与否在宫颈癌组织中miR—218相对表达水平差异均有统计学意义(P < 0.05)，而比较肿瘤直径大小、不同年龄、临床分期和绝经与否的宫颈癌组织中miR—218表达水平差异均无统计学意义(P > 0.05)。见表1。
图1 SYBR Green实时荧光定量PCR扩增曲线
图2 SYBR Green实时荧光定量PCR溶解曲线
图3 不同组织中miR—218的相对表达量
1：正常宫颈组织；2：宫颈上皮内瘤变组织；3：宫颈癌组织 *P < 0.01 vs正常宫颈组织；#P < 0.01 vs宫颈上皮内瘤变组织
表1 宫颈癌组织miR—218表达水平与临床病理特征之间的关系
3 讨论
宫颈癌是世界上最常见的妇科肿瘤，其发病率近年来呈逐渐上升趋势。宫颈癌的病因复杂，与染色体突变、HPV感染、单核苷酸多态性变化等密切相关[4]。大量研究证实，恶性肿瘤的发生发展、转移、浸润都伴随着微小RNA表达量的变化，如直肠癌、淋巴瘤、肺癌等[5]。Lui WO等[6]应用克隆测序法分析了正常宫颈组织和人宫颈癌细胞株两种基因组中miRNA编码位点拷贝数缺失和(或)扩增的情况，结果显示在宫颈癌细胞株中miR—21表达上调，而miR—196b、miR—23b和miR—143表达显著下调。近年miR—218在肿瘤中的异常表达备受关注，多种恶性肿瘤中存在的miR—218表达下调现象，如宫颈癌、胃癌、乳腺癌[7，8]。
本实验中通过实时荧光定量PCR法检测了正常组织、宫颈上皮内瘤变组织以及宫颈癌组织中miR—218表达的变化，得知宫颈上皮内瘤变时miR—218表达下调，而宫颈癌时miR—218表达下调更显著。通过比较宫颈癌组织中肿瘤直径的大小、不同年龄、临床分期和绝经与否与miR—218表达水平的相关性，结果提示miR—218表达水平与以上四个因素关系不密切。而通过比较宫颈癌组织中不同的病理分级、间质浸润深度、淋巴结转移与否与miR—218表达的相关性，结果表明miR—218表达下调与该三方面的因素密切相关。说明miR—218表达水平下调在宫颈癌的发生发展中发挥重要作用，并与宫颈癌的浸润和转移等临床病理特征密切相关。因此miR—218为肿瘤靶向治疗提供了新靶点，并可作为治疗宫颈癌及评价预后的参考指标。
随着基因组技术的突飞猛进，研究非编码序列的临床意义越来越重要。深入研究微小RNA在肿瘤发生发展中的作用成为近年来的研究热点，不仅可以为寻找肿瘤特异性诊断的标志物提供依据，还能提供治疗肿瘤的新靶点[9，10]。如能有效地将特异的miRNA或者其抑制剂转入宫颈癌的癌细胞中，同样能提高对宫颈癌的早期诊断、治疗和判断预后。
[参考文献]
[1] 郭晓红. 宫颈癌差异蛋白的表达及化疗药物对宫颈癌Hela细胞的作用[D]. 广州：南方医科大学，2009.
[2] 孙海玲，冯丽华. HPV检测在宫颈疾病检查中的临床意义[C]. 东北三省第四届妇产科学术会议论文汇编，2008：97—98.
[3] 李英杰. miR—218与宫颈癌恶性程度的相关性及其作用机制的初步探讨[D]. 济南：山东大学，2010.
[4] Tsubokura M，Komatsu T，Kami M. The prevalence of high—risk human papillomavirus in women with different types of cervical cancer[J]. Ann Intern Med ......
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