柱凝胶技术在输血前抗体筛检中的应用分析及方法学探讨(1)
[摘要] 目的 对6463例输血、妊娠史的受血者进行不规则抗体(IAb)筛查，并评估微柱凝胶技术(MGT)、聚凝胺技术(MPT)和抗人球蛋白试管法(CTT)在输血前抗体筛检中IAb阳性标本的应用价值。 方法 IAb抗D、抗E阳性者，用三种方法进行连续倍比稀释效价比对，检测其灵敏度。 结果 抗D抗体三种方法灵敏度检测差异无统计学意义(P > 0.05)；抗E抗体检测MPT法与CTT法差异无统计学意义(P > 0.05)，MGT法与CTT法比较差异有高度统计学意义(P < 0.01)。 结论 检测中发现MGT的灵敏度最高，其灵敏度较MPT高2～4个滴度，较CTT法高出3～5个滴度，往往MPT法和CTT法对IAb较弱的标本为阴性时，MGT法仍能检出。MGT法操作简便、省去洗涤步骤、重复性好，易于批量和标准化操作，适于在血型血清学的检测中广泛应用。
[关键词] 柱凝胶技术；不规则抗体；聚凝胺技术；抗人球蛋白试验
[中图分类号] R446.6 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701(2012)28-0111-03
, http://www.100md.com
抗体筛选是输血前检查的重要项目之一。通过抗体筛选可以避免含有弱抗体的受血者输入含有相应抗原的红细胞而受到免疫刺激， 甚至发生溶血性输血反应， 同时也为受血者寻找相合的血液提供理论依据。不规则抗体(IAb)是指ABO血型系统抗A、抗B以外的血型抗体，是引起免疫性溶血性输血反应及疑难配型的主要原因，多为IgG抗体，患者反复多次输血和妊娠可产生免疫性抗体导致迟发性输血反应，输血前及时检测患者血清中IAb，是安全输血的重要保证，我院开展柱凝胶技术(MGT)对所有输血、妊娠史的受血者进行IAb筛查，并对IAb阳性标本用微柱凝胶技术(MGT)、聚凝胺技术(MPT)、抗人球蛋白试管法(CTT)三种方法进行对比分析，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 标本来源
2007年11月～2011年10月本院手术备血和治疗用血的受血者6 463例，其中男3 602例，女2 861例，年龄1～95岁。
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1.2 仪器与试剂
微柱凝胶卡、专用孵育箱和离心机，均为长春博迅生物技术有限公司提供，Lab筛检细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ谱细胞为上海血液生物有限公司产品；IgG抗-D血清由上海生物医药制品有限公司提供；抗人球蛋白血清抗IgGC3由上海市血液生物有限公司提供，MPT试剂盒(中山生科试剂仪器有限公司产品)；O 型试剂红细胞的制备：取3 个不同O 型RhD 阳型献血员的红细胞混合，用0.9% 生理盐水洗涤3 次。将洗涤好的红细胞用0.9%生理盐水配成浓度为0.8%红细胞悬液备用。
1.3 方法
受血者抽取EDTA-k2抗凝血3 mL，标本必须是输血前3 d，分离血浆离心5 min。
1.3.1 微柱凝胶卡式法(MGT) 微柱卡编号，向标记Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的三个微柱反应孔各加0.8%～1.0%筛检细胞50 μL，再向对应微柱管中加入受检者血浆50 μL，每次均设阴阳性对照，置37℃孵育器15 min，专用离心机离心5 min，900 rpm 2 min，1 500 rpm 3 min，取出观察结果，红细胞相互凝集处于凝胶柱的上方为阳性，反之，筛检细胞能通过分离柱，沉降到凝胶柱底部为阴性。用1～10号谱细胞采用微柱凝胶法，作抗体特异性鉴定。
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1.3.2 聚凝胺法(MPT)检测Lab 待测管加受血者血浆1滴，加3%～5%筛检细胞悬液1滴，各管加低离子介质(LIM)3滴，混匀，室温放置30 s，加入polyberne试剂2滴，3 500 r/min离心15 s轻摇，肉眼可见明显凝集，各管加假凝集稀释液1滴，轻摇，非特异性凝集1 min后消失为阴性，反之为阳性。
1.3.3 试管法间接抗人球蛋白试验(CTT) 2滴受血者血浆与1滴5%筛检细胞混合后至37℃孵育1 h，生理盐水洗涤红细胞3次，将洗涤后的红细胞加入抗人球蛋白试剂于3 000 rpm离心15 s，显微镜观察，阳性对照和被检管出现凝集，即为阳性，而阴性管不凝集。
1.3.4 比对MGT、CTT、MPT灵敏度，对不完全抗体阳性抗E和抗D受检者血浆，用生理盐水进行连续倍比稀释，1∶2至1∶1 024，稀释后的血浆按抗体筛选方法做效价测定，反应到达1+的最大稀释倍数为该抗体的效价，稀释后的红细胞悬液用传统抗球蛋白法进行检测.平行实验重复5次。
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1.4 统计学方法
采用SPSS13. 0 统计学软件进行分析。采用几何平均值计算法，计算CTT法与MGT法测抗-D和抗E效价的平均值，CTT法与MGT、MPT法灵敏度检测结果比较采用几何均数法的t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 三种方法对28例抗D、抗E抗体阳性效价比较
MGT法测定IAb，将抗D、抗E阳性受血者标本连续倍比稀释为1∶2至1∶1 024进行检测，结果红细胞悬浮在凝胶柱的上方和中间，由强到弱有肉眼可见的凝集颗粒，阳性的最高稀释度效价为1∶1 024；MPT法测定的最高稀释度为1∶64时肉眼可见明显的凝集，1∶128显微镜下可见红细胞呈弱凝集；CTT法测定，在最高稀释度为1∶64时肉眼可见明显的凝集，1∶128显微镜下未见凝集。见表1。对抗体阳性标本采用血清半定量三种方法检出率分别为MGT法100%，MPT法90%，CTT法72%，对抗D抗体三种方法灵敏度检测，MPT法与CTT法差异无统计学意义(P > 0.05)，MGT法与CTT法比较差异有统计学意义(P < 0.01)。
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2.2 52例Lab阳性抗体分布
采用MGT法对6 463例受血者进行不规则抗体筛查，MPT法筛检出IAb阳性52例，阳性率0.80%(52/6 463)，其中男22例，女30例，男性均有输血史，女性12例有输血史，25例有妊娠史，其中7例既有妊娠史又有输血史。用MGT法进一步作特异性抗体分型，鉴定出特异性39例、抗D 18例、抗E 10例、抗C 2例、抗c 2例， 抗-Mia 1例、抗-Jka 2 例、抗-Lea 1例、自身抗体3例、未鉴定出特异性抗体13例。见表2。抗E效价抗体效价比对，MPT法与CTT法差异无统计学意义(P > 0.05)，MGT法与CTT法比较差异有高度统计学意义(P < 0.01)，显示CTT法和MPT法在IAb较弱时可造成漏检。, http://www.100md.com(孔祥骞)
[关键词] 柱凝胶技术；不规则抗体；聚凝胺技术；抗人球蛋白试验
[中图分类号] R446.6 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701(2012)28-0111-03
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抗体筛选是输血前检查的重要项目之一。通过抗体筛选可以避免含有弱抗体的受血者输入含有相应抗原的红细胞而受到免疫刺激， 甚至发生溶血性输血反应， 同时也为受血者寻找相合的血液提供理论依据。不规则抗体(IAb)是指ABO血型系统抗A、抗B以外的血型抗体，是引起免疫性溶血性输血反应及疑难配型的主要原因，多为IgG抗体，患者反复多次输血和妊娠可产生免疫性抗体导致迟发性输血反应，输血前及时检测患者血清中IAb，是安全输血的重要保证，我院开展柱凝胶技术(MGT)对所有输血、妊娠史的受血者进行IAb筛查，并对IAb阳性标本用微柱凝胶技术(MGT)、聚凝胺技术(MPT)、抗人球蛋白试管法(CTT)三种方法进行对比分析，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 标本来源
2007年11月～2011年10月本院手术备血和治疗用血的受血者6 463例，其中男3 602例，女2 861例，年龄1～95岁。
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1.2 仪器与试剂
微柱凝胶卡、专用孵育箱和离心机，均为长春博迅生物技术有限公司提供，Lab筛检细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ谱细胞为上海血液生物有限公司产品；IgG抗-D血清由上海生物医药制品有限公司提供；抗人球蛋白血清抗IgGC3由上海市血液生物有限公司提供，MPT试剂盒(中山生科试剂仪器有限公司产品)；O 型试剂红细胞的制备：取3 个不同O 型RhD 阳型献血员的红细胞混合，用0.9% 生理盐水洗涤3 次。将洗涤好的红细胞用0.9%生理盐水配成浓度为0.8%红细胞悬液备用。
1.3 方法
受血者抽取EDTA-k2抗凝血3 mL，标本必须是输血前3 d，分离血浆离心5 min。
1.3.1 微柱凝胶卡式法(MGT) 微柱卡编号，向标记Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的三个微柱反应孔各加0.8%～1.0%筛检细胞50 μL，再向对应微柱管中加入受检者血浆50 μL，每次均设阴阳性对照，置37℃孵育器15 min，专用离心机离心5 min，900 rpm 2 min，1 500 rpm 3 min，取出观察结果，红细胞相互凝集处于凝胶柱的上方为阳性，反之，筛检细胞能通过分离柱，沉降到凝胶柱底部为阴性。用1～10号谱细胞采用微柱凝胶法，作抗体特异性鉴定。
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1.3.2 聚凝胺法(MPT)检测Lab 待测管加受血者血浆1滴，加3%～5%筛检细胞悬液1滴，各管加低离子介质(LIM)3滴，混匀，室温放置30 s，加入polyberne试剂2滴，3 500 r/min离心15 s轻摇，肉眼可见明显凝集，各管加假凝集稀释液1滴，轻摇，非特异性凝集1 min后消失为阴性，反之为阳性。
1.3.3 试管法间接抗人球蛋白试验(CTT) 2滴受血者血浆与1滴5%筛检细胞混合后至37℃孵育1 h，生理盐水洗涤红细胞3次，将洗涤后的红细胞加入抗人球蛋白试剂于3 000 rpm离心15 s，显微镜观察，阳性对照和被检管出现凝集，即为阳性，而阴性管不凝集。
1.3.4 比对MGT、CTT、MPT灵敏度，对不完全抗体阳性抗E和抗D受检者血浆，用生理盐水进行连续倍比稀释，1∶2至1∶1 024，稀释后的血浆按抗体筛选方法做效价测定，反应到达1+的最大稀释倍数为该抗体的效价，稀释后的红细胞悬液用传统抗球蛋白法进行检测.平行实验重复5次。
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1.4 统计学方法
采用SPSS13. 0 统计学软件进行分析。采用几何平均值计算法，计算CTT法与MGT法测抗-D和抗E效价的平均值，CTT法与MGT、MPT法灵敏度检测结果比较采用几何均数法的t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 三种方法对28例抗D、抗E抗体阳性效价比较
MGT法测定IAb，将抗D、抗E阳性受血者标本连续倍比稀释为1∶2至1∶1 024进行检测，结果红细胞悬浮在凝胶柱的上方和中间，由强到弱有肉眼可见的凝集颗粒，阳性的最高稀释度效价为1∶1 024；MPT法测定的最高稀释度为1∶64时肉眼可见明显的凝集，1∶128显微镜下可见红细胞呈弱凝集；CTT法测定，在最高稀释度为1∶64时肉眼可见明显的凝集，1∶128显微镜下未见凝集。见表1。对抗体阳性标本采用血清半定量三种方法检出率分别为MGT法100%，MPT法90%，CTT法72%，对抗D抗体三种方法灵敏度检测，MPT法与CTT法差异无统计学意义(P > 0.05)，MGT法与CTT法比较差异有统计学意义(P < 0.01)。
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2.2 52例Lab阳性抗体分布
采用MGT法对6 463例受血者进行不规则抗体筛查，MPT法筛检出IAb阳性52例，阳性率0.80%(52/6 463)，其中男22例，女30例，男性均有输血史，女性12例有输血史，25例有妊娠史，其中7例既有妊娠史又有输血史。用MGT法进一步作特异性抗体分型，鉴定出特异性39例、抗D 18例、抗E 10例、抗C 2例、抗c 2例， 抗-Mia 1例、抗-Jka 2 例、抗-Lea 1例、自身抗体3例、未鉴定出特异性抗体13例。见表2。抗E效价抗体效价比对，MPT法与CTT法差异无统计学意义(P > 0.05)，MGT法与CTT法比较差异有高度统计学意义(P < 0.01)，显示CTT法和MPT法在IAb较弱时可造成漏检。, http://www.100md.com(孔祥骞)