乌司他丁联合利多卡因对大鼠肺缺血再灌注损伤的保护作用(2)
参见附件(12kb)。
1.3动脉血气分析
各组大鼠处死前经颈动脉取血0.5 mL并用肝素抗凝，避免与空气接触，测定PaO2值，PaO2反应组织供氧和气体交换情况，是反应肺功能的重要指标。
1.4肺组织形态学观察及肺组织湿/干(wet/dry，W/D)值的计算
大鼠处死后，立即留取左肺上半叶称湿重(W)并记录，然后置于60℃烘箱中，48h后称干重(D)，求得肺组织湿/干 (W/D) 值，肺组织W/D值反映肺组织水肿程度；留取左肺下半叶进行肺组织病理学分析，将肺组织放入4%甲醛中固定，然后依次进行脱水、常规石蜡包埋、切片、苏木精-伊红(HE)染色。光镜下HE染色观察肺组织的病理形态学变化。
1.5肺组织中TNF-α表达水平的检测
左肺下半叶进行免疫组化检测，用免疫组化SABC法测定大鼠肺组织TNF-α表达水平的变化。以 PBS 替代一抗孵育作为阴性对照，DAB 显色。以胞浆出现棕黄色颗粒为阳性标准，光学显微镜观察 TNF-α蛋白表达、分布情况， 在显微镜下放大 400 倍，随机选择不重叠的 5 个视野，计算阳性细胞数占总细胞数的百分比。
1.6统计学处理
所有数据采用SPSS17.0统计学分析软件进行处理，测定结果用均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析(One Way ANOVA)，两两比较采用LSD-t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1不同时间点各组大鼠PaO2的变化情况
I/R组PaO2值明显降低，且随着时间的延长PaO2值呈进行性下降，相同时间点与I/R组对比，S组、L组、U组和L+U组的PaO2值明显上升，差异有统计学意义(P < 0.01)；相同时点L组与U组比较PaO2值无统计学意义(P > 0.05)；相同时点L+U组与L组或U组分别比较PaO2值明显上升，差异有统计学意义(P < 0.01)。见表1。
表1 各组大鼠不同时间点的PaO2值变化(x±s，mmHg)
注：各时点各组与I/R组比较具有统计学意义(P < 0.01)；相同时点L组与U组比较无统计学意义 (P > 0.05)
2.2大鼠肺组织形态学观察及肺湿/干质量(wet/dry mass，W/D)值的计算
2.2.1肺组织大体改变 S组大鼠左侧肺叶色泽、形态正常，表面无出血点，胸腔内无渗出液；I/R组大鼠可见左侧肺叶充血水肿，色泽暗红，表面可见紫红色斑块且胸腔内可见淡红色渗出液；L组和U组大鼠左侧肺叶轻度充血，表面呈淡粉红色，局部肺叶表面可见暗红色出血点，肺叶弹性良好，胸腔内可见少量淡黄色稀薄渗出液；L+U组大鼠较上述改变更轻微。
2.2.2病理改变 S组大鼠肺组织未发现病理改变；I/R组大鼠肺组织可见明显水肿、渗出液较多、腔内可见红细胞、毛细血管扩张、淤血、炎性细胞浸润；L组和U组大鼠肺泡壁毛细血管扩张，淤血程度较I/R组轻，部分肺间质及肺泡水肿，肺泡腔内渗出物明显减少，少量炎性细胞浸润。L+U组大鼠改变更轻微。
2.2.3各组大鼠肺组织W/D值的比较 S组肺组织无明显水肿，I/R组肺组织水肿严重，再灌注后I/R组中肺组织W/D值随着再灌注时间的延长呈进行性增加，相同时间点与I/R组对比，S组、L组、U组和L+U组的W/D值明显下降，差异有统计学意义(P < 0.01)，相同时间点L组与U组W/D值比较无显著差异(P > 0.05)；相同时点L+U组与L组或U组分别比较W/D值明显下降 ......
1.3动脉血气分析
各组大鼠处死前经颈动脉取血0.5 mL并用肝素抗凝，避免与空气接触，测定PaO2值，PaO2反应组织供氧和气体交换情况，是反应肺功能的重要指标。
1.4肺组织形态学观察及肺组织湿/干(wet/dry，W/D)值的计算
大鼠处死后，立即留取左肺上半叶称湿重(W)并记录，然后置于60℃烘箱中，48h后称干重(D)，求得肺组织湿/干 (W/D) 值，肺组织W/D值反映肺组织水肿程度；留取左肺下半叶进行肺组织病理学分析，将肺组织放入4%甲醛中固定，然后依次进行脱水、常规石蜡包埋、切片、苏木精-伊红(HE)染色。光镜下HE染色观察肺组织的病理形态学变化。
1.5肺组织中TNF-α表达水平的检测
左肺下半叶进行免疫组化检测，用免疫组化SABC法测定大鼠肺组织TNF-α表达水平的变化。以 PBS 替代一抗孵育作为阴性对照，DAB 显色。以胞浆出现棕黄色颗粒为阳性标准，光学显微镜观察 TNF-α蛋白表达、分布情况， 在显微镜下放大 400 倍，随机选择不重叠的 5 个视野，计算阳性细胞数占总细胞数的百分比。
1.6统计学处理
所有数据采用SPSS17.0统计学分析软件进行处理，测定结果用均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析(One Way ANOVA)，两两比较采用LSD-t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1不同时间点各组大鼠PaO2的变化情况
I/R组PaO2值明显降低，且随着时间的延长PaO2值呈进行性下降，相同时间点与I/R组对比，S组、L组、U组和L+U组的PaO2值明显上升，差异有统计学意义(P < 0.01)；相同时点L组与U组比较PaO2值无统计学意义(P > 0.05)；相同时点L+U组与L组或U组分别比较PaO2值明显上升，差异有统计学意义(P < 0.01)。见表1。
表1 各组大鼠不同时间点的PaO2值变化(x±s，mmHg)
注：各时点各组与I/R组比较具有统计学意义(P < 0.01)；相同时点L组与U组比较无统计学意义 (P > 0.05)
2.2大鼠肺组织形态学观察及肺湿/干质量(wet/dry mass，W/D)值的计算
2.2.1肺组织大体改变 S组大鼠左侧肺叶色泽、形态正常，表面无出血点，胸腔内无渗出液；I/R组大鼠可见左侧肺叶充血水肿，色泽暗红，表面可见紫红色斑块且胸腔内可见淡红色渗出液；L组和U组大鼠左侧肺叶轻度充血，表面呈淡粉红色，局部肺叶表面可见暗红色出血点，肺叶弹性良好，胸腔内可见少量淡黄色稀薄渗出液；L+U组大鼠较上述改变更轻微。
2.2.2病理改变 S组大鼠肺组织未发现病理改变；I/R组大鼠肺组织可见明显水肿、渗出液较多、腔内可见红细胞、毛细血管扩张、淤血、炎性细胞浸润；L组和U组大鼠肺泡壁毛细血管扩张，淤血程度较I/R组轻，部分肺间质及肺泡水肿，肺泡腔内渗出物明显减少，少量炎性细胞浸润。L+U组大鼠改变更轻微。
2.2.3各组大鼠肺组织W/D值的比较 S组肺组织无明显水肿，I/R组肺组织水肿严重，再灌注后I/R组中肺组织W/D值随着再灌注时间的延长呈进行性增加，相同时间点与I/R组对比，S组、L组、U组和L+U组的W/D值明显下降，差异有统计学意义(P < 0.01)，相同时间点L组与U组W/D值比较无显著差异(P > 0.05)；相同时点L+U组与L组或U组分别比较W/D值明显下降 ......
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