纤支镜检查联合BALF细胞p53突变的检测对肺癌的诊断价值(1)
[摘要] 目的 探讨纤支镜检查联合支气管肺泡灌洗液中细胞p53突变检测对肺癌的诊断价值。方法 对可疑肺癌患者行纤支镜检查，并以聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析法检测BALF细胞p53的第5、6、7、8外显子突变情况。 结果 在最终确诊的68例肺癌患者中，纤支镜检查诊断肺癌49例， p53突变检测发现37例，纤支镜检查与检测BALF中细胞p53突变联合的方法共同检出61例肺癌患者，阳性率高达89.7%，较单独纤支镜检查差异有高度统计学意义(P < 0.01)。结论 PCR-SSCP法检测BALF中p53突变可弥补纤支镜检查的不足，有助提高肺癌的诊断率。
[关键词] 肺癌；纤支镜检查；支气管肺泡灌洗液；p53基因；基因突变
[中图分类号] R734.2 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701(2013)03-0062-03
肺癌是对人类健康和生命威胁最严重和最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率逐年上升。世界范围内其发病率居各肿瘤之首[1]。但对肺癌患者的诊断和鉴别却是临床工作的难点。目前纤支镜在临床应用非常广泛，因其能进行活检和细胞学检查，对病变性质的判断有着重要意义，但对肺癌诊断的灵敏性取决于肿块的位置、大小、形态等因素，对直径小于2 cm的周围型病变诊断率则较低[2]。现代分子生物学研究认为，肿瘤的发生与基因变化有关，癌基因的活化和抑癌基因的突变是其发生发展的关键环节。p53是迄今为止发现的与人类肿瘤相关性最高的基因之一，本实验通过检测支气管肺泡灌洗液中细胞p53突变，旨在弥补纤支镜在肺癌诊断中的不足，寻求敏感的肺癌诊断新方法。
, 百拇医药
1 资料与方法
1.1 一般材料
选取2006年1月～2011年12月临床上可疑的肺癌患者82例，男48例，女34例，年龄23～72岁，平均(58.3±8.6)岁，均具有完整的临床资料，所有病例均经病理学或细胞学确诊，其中肺癌患者68例，肺结核、炎性假瘤等良性病变14例。肺癌组中鳞癌38例，腺癌21例，其他9例；根据2002年UICC制订的标准行TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期41例，Ⅲ～Ⅳ期27例；分化程度为高、中分化者36例，低、未分化者32例。所取病例均排除其他系统肿瘤以及风湿病、糖尿病等疾病。
1.2 纤维支气管镜检查
采用日本Olympus纤维支气管镜，按常规进行支气管镜检查。2%的利多卡因局部麻醉后，根据影像学提供的病变位置，将纤维支气管镜经鼻腔插入肺部支气管病变处，对病变肺段进行支气管肺泡灌洗，经活检孔快速注入预热为37 ℃的无菌生理盐水，负压吸引回收，共灌洗两次，回收液过滤后3000 r/min离心10 min，弃上清留细胞沉淀-80 ℃保存。随后对病变部位进行活检和刷片，标本分别送病检和细胞学检查。
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1.3 DNA提取
采用常规蛋白酶K消化，酚-氯仿-异戊醇抽提法提取DNA，无水乙醇沉淀，70%乙醇洗涤，pH8.0的Tris-EDTA溶液50 μL溶解。以紫外分光光度法测定DNA的纯度及浓度，A260/A280比值在1.8～2.0之间可用于下一步实验。若DAN纯度<1.6， 表明有残存酚或蛋白含量太高，应用氯仿再次抽提纯化。提取的DNA产物分装保存于-20℃冰箱。
1.4 PCR扩增
选择常发生突变的研究热点p53的5～8外显子[3]，引物设计参考文献[4，5]，序列如下，第5外显子：5'-TTC CTC TTC CTG CAG TAC TC和5'-CAG CTG CTC ACC ATC GCT AT；第6外显子：5'-ACA GGG CTG GTT GCC CAG GGT和5'-AGT TGC AAA CCA GAC CTC AGG CG；第7外显子：5'-TCC TAG GTT GGC TCT GAC TGT和5'-AGT GGC CCT GAC CTG GAG TCT；第8外显子：5'-GGG ACA GGT AGG ACC TGA TTT CCT T和5'-ATC TGA AGG CAT AAC TGC ACC CTT GG，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系：10×TaqDNA 聚合酶缓冲液(含Mg2+) 5 μL，10 mM dNTP 1 μL，25 mM MgCl2 4 μL，上、下游引物(10 mM)各1 μL ，Taq DNA聚合酶1 U，模板DNA 0.2～0.3 μg，补ddH2O至50 μL。反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性40 s，54℃～62℃退火40 s，72℃延伸60 s，共36个循环，72℃再延伸10 min。反应完成后，取5μL产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增情况，如出现清晰的目的条带，且无杂带的PCR产物，可行SSCP分析。
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1.5 SSCP分析
将PCR扩增产物与变性上样液(98%甲酰胺，10 mM EDTA，0.03%二甲苯青，0.05%溴酚蓝)1︰2混合，98℃变性10 min，冰浴骤冷5 min，快速上样于8%非变性聚丙烯酰胺凝胶(交联度29∶1)，5 V/cm垂直电泳，电泳缓冲液为1×TBE，电泳4～6 h。取下凝胶进行银染，于暗室中硝酸银染色30 min，3%碳酸钠显色，至凝胶出现褐色条带，背景为透明的淡黄色时弃去染色液，10%冰醋酸终止显色，于凝胶成像系统拍照并保存。用对照组扩增的SSCP带型作为阴性对照，如出现单链DNA条带数目的增加﹑减少或位置的相对移位则判断为有突变发生。
1.6 统计学分析
本组所得数据行χ2检验，数据统计在SPSS 13.0软件上进行，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
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2.1 PCR-SSCP检测结果
p53各外显子均扩增出了相应的PCR产物(图1)。SSCP分析发现，对照组14例均未发现突变，肺癌组68例中有37例发生突变，突变发生率为54.4%(图2)。其中男性21例(21/40)，女生16例(16/28)，两者比较差异无统计学意义(χ2=0.143， P > 0.05)。按病理分类，鳞癌26例(68.4%，26/38)，腺癌7例(33.3%，7/21)，其他4例(44.4%，4/9)，鳞癌与腺癌中突变比较差异有统计学意义(χ2=6.756，P < 0.01)。按TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期突变20例(48.8%，20/41)，Ⅲ～Ⅳ期突变17例(63.0%，17/27)，两者比较差异无统计学意义(χ2=1.320，P > 0.05)。按分化程度，高、中分化者突变14例(38.9%，14/36)，低、未分化者突变23例(71.9%，23/32)，两者比较差异有统计学意义(χ2=7.431，P < 0.01)(表1)。检出各外显子突变情况：第5外显子7例，第6外显子10例，第7外显子8例，第8外显子12例。
, 百拇医药(陈保红 陈众博 朱平光 邓在春)
[关键词] 肺癌；纤支镜检查；支气管肺泡灌洗液；p53基因；基因突变
[中图分类号] R734.2 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701(2013)03-0062-03
肺癌是对人类健康和生命威胁最严重和最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率逐年上升。世界范围内其发病率居各肿瘤之首[1]。但对肺癌患者的诊断和鉴别却是临床工作的难点。目前纤支镜在临床应用非常广泛，因其能进行活检和细胞学检查，对病变性质的判断有着重要意义，但对肺癌诊断的灵敏性取决于肿块的位置、大小、形态等因素，对直径小于2 cm的周围型病变诊断率则较低[2]。现代分子生物学研究认为，肿瘤的发生与基因变化有关，癌基因的活化和抑癌基因的突变是其发生发展的关键环节。p53是迄今为止发现的与人类肿瘤相关性最高的基因之一，本实验通过检测支气管肺泡灌洗液中细胞p53突变，旨在弥补纤支镜在肺癌诊断中的不足，寻求敏感的肺癌诊断新方法。
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1.1 一般材料
选取2006年1月～2011年12月临床上可疑的肺癌患者82例，男48例，女34例，年龄23～72岁，平均(58.3±8.6)岁，均具有完整的临床资料，所有病例均经病理学或细胞学确诊，其中肺癌患者68例，肺结核、炎性假瘤等良性病变14例。肺癌组中鳞癌38例，腺癌21例，其他9例；根据2002年UICC制订的标准行TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期41例，Ⅲ～Ⅳ期27例；分化程度为高、中分化者36例，低、未分化者32例。所取病例均排除其他系统肿瘤以及风湿病、糖尿病等疾病。
1.2 纤维支气管镜检查
采用日本Olympus纤维支气管镜，按常规进行支气管镜检查。2%的利多卡因局部麻醉后，根据影像学提供的病变位置，将纤维支气管镜经鼻腔插入肺部支气管病变处，对病变肺段进行支气管肺泡灌洗，经活检孔快速注入预热为37 ℃的无菌生理盐水，负压吸引回收，共灌洗两次，回收液过滤后3000 r/min离心10 min，弃上清留细胞沉淀-80 ℃保存。随后对病变部位进行活检和刷片，标本分别送病检和细胞学检查。
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1.3 DNA提取
采用常规蛋白酶K消化，酚-氯仿-异戊醇抽提法提取DNA，无水乙醇沉淀，70%乙醇洗涤，pH8.0的Tris-EDTA溶液50 μL溶解。以紫外分光光度法测定DNA的纯度及浓度，A260/A280比值在1.8～2.0之间可用于下一步实验。若DAN纯度<1.6， 表明有残存酚或蛋白含量太高，应用氯仿再次抽提纯化。提取的DNA产物分装保存于-20℃冰箱。
1.4 PCR扩增
选择常发生突变的研究热点p53的5～8外显子[3]，引物设计参考文献[4，5]，序列如下，第5外显子：5'-TTC CTC TTC CTG CAG TAC TC和5'-CAG CTG CTC ACC ATC GCT AT；第6外显子：5'-ACA GGG CTG GTT GCC CAG GGT和5'-AGT TGC AAA CCA GAC CTC AGG CG；第7外显子：5'-TCC TAG GTT GGC TCT GAC TGT和5'-AGT GGC CCT GAC CTG GAG TCT；第8外显子：5'-GGG ACA GGT AGG ACC TGA TTT CCT T和5'-ATC TGA AGG CAT AAC TGC ACC CTT GG，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系：10×TaqDNA 聚合酶缓冲液(含Mg2+) 5 μL，10 mM dNTP 1 μL，25 mM MgCl2 4 μL，上、下游引物(10 mM)各1 μL ，Taq DNA聚合酶1 U，模板DNA 0.2～0.3 μg，补ddH2O至50 μL。反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性40 s，54℃～62℃退火40 s，72℃延伸60 s，共36个循环，72℃再延伸10 min。反应完成后，取5μL产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增情况，如出现清晰的目的条带，且无杂带的PCR产物，可行SSCP分析。
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将PCR扩增产物与变性上样液(98%甲酰胺，10 mM EDTA，0.03%二甲苯青，0.05%溴酚蓝)1︰2混合，98℃变性10 min，冰浴骤冷5 min，快速上样于8%非变性聚丙烯酰胺凝胶(交联度29∶1)，5 V/cm垂直电泳，电泳缓冲液为1×TBE，电泳4～6 h。取下凝胶进行银染，于暗室中硝酸银染色30 min，3%碳酸钠显色，至凝胶出现褐色条带，背景为透明的淡黄色时弃去染色液，10%冰醋酸终止显色，于凝胶成像系统拍照并保存。用对照组扩增的SSCP带型作为阴性对照，如出现单链DNA条带数目的增加﹑减少或位置的相对移位则判断为有突变发生。
1.6 统计学分析
本组所得数据行χ2检验，数据统计在SPSS 13.0软件上进行，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
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2.1 PCR-SSCP检测结果
p53各外显子均扩增出了相应的PCR产物(图1)。SSCP分析发现，对照组14例均未发现突变，肺癌组68例中有37例发生突变，突变发生率为54.4%(图2)。其中男性21例(21/40)，女生16例(16/28)，两者比较差异无统计学意义(χ2=0.143， P > 0.05)。按病理分类，鳞癌26例(68.4%，26/38)，腺癌7例(33.3%，7/21)，其他4例(44.4%，4/9)，鳞癌与腺癌中突变比较差异有统计学意义(χ2=6.756，P < 0.01)。按TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期突变20例(48.8%，20/41)，Ⅲ～Ⅳ期突变17例(63.0%，17/27)，两者比较差异无统计学意义(χ2=1.320，P > 0.05)。按分化程度，高、中分化者突变14例(38.9%，14/36)，低、未分化者突变23例(71.9%，23/32)，两者比较差异有统计学意义(χ2=7.431，P < 0.01)(表1)。检出各外显子突变情况：第5外显子7例，第6外显子10例，第7外显子8例，第8外显子12例。
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