槲皮素对TGF—β诱导的人肺癌A549细胞上皮间质转化的影响(1)
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[摘要] 目的 探讨槲皮素对TGF-β诱导的人肺癌A549细胞上皮间质转化的影响。 方法 在体外分别采取槲皮素及阴性对照DMSO干预经或不经TGF-β(10 ng/mL)诱导的人肺癌A549细胞12、24、48、72 h后，MTT法检测不同浓度槲皮素对A549细胞增殖的影响；RT-PCR和Westem blot实验检测上皮间质转化标志性因子E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的表达变化。 结果 与阴性对照组相比，不同浓度槲皮素作用的实验组A549细胞的增殖能力降低，同时在mRNA和蛋白水平E-cadherin上调以及N-cadherin、Vimentin的表达下调(P < 0.05)。 结论 槲皮素能够抑制TGF-β 诱导的人肺癌A549细胞的增殖，且呈时间-剂量依赖性，阻止A549细胞发生上皮间质转化，降低A549细胞的迁移侵袭运动能力。
[关键词] 槲皮素；转化生长因子β(TGF-β)；A549细胞；上皮间质转化(EMT)
[中图分类号] R734.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2013)05-0006-03
肺腺癌是肺癌最常见的组织学类型，约占所有肺癌的50%，且70%～90%手术切除的肺腺癌为浸润性腺癌[1]。肺腺癌的浸润转移是一个非常复杂的过程，涉及多种因素和多种机制。目前，上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在肺腺癌浸润转移中的作用引起研究者的关注。EMT是肿瘤浸润、转移的一个非常重要的机制，与肿瘤后期的转移和纤维化关系密切，研究EMT及其相关信号传导通路可为控制肺癌的发生发展提供有效策略[2]。在EMT发生过程中，肿瘤组织中的上皮细胞标志物E-cadherin下调，间质细胞标记物N-cadherin和Vimentin上调。EMT的发生是一个复杂的过程，多种细胞因子和信号通路参与其调控[3]。其中，转化生长因子β(TGF-β)是一个比较明确的可诱导上皮发生EMT 的重要诱导因子[4，5]。
槲皮素(Quercetin，Que)是黄酮类化合物重要的一员，属于黄酮醇类化合物，在植物中多以糖苷的形式存在。槲皮素及其衍生物具有抗心律失常、抗血小板聚集、扩张血管、抗氧化、抗肿瘤等作用，因此槲皮素及其衍生物的合成和药理活性研究受到越来越多人的关注，但其作用机制目前仍不清楚。本研究旨在通过观察槲皮素对TGF-β诱导A549上皮细胞间质转化(EMT)的影响，为开发新的抗肺癌药物提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞株 人肺腺癌细胞株 A549购自中科院上海细胞库。
1.1.2 主要试剂及设备 H-DMEM培养基购自Gibco公司；胎牛血清(FBS)购自Hyclone公司；兔抗人E-cadherin单抗、兔抗人N-cadherin单抗、兔抗人Vimentin单抗购自Epitomics公司；兔抗人β-actin单抗购自北京中衫金桥公司；槲皮素(Quercetin)、TGF-β、四甲基偶氮唑盐(MTT)和二甲亚枫(DMSO)均购自美国 Sigma 公司；Trizol、RT-PCR逆转录试剂盒、Premix Taq酶、DNA marker均购自TaKaRa公司；凯基全蛋白提取试剂盒购自凯基生物科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、PVDF膜、琼脂糖(Agarose)、TAE(50×)均购自Beyotime(碧云天)公司；ECL发光试剂盒购自Millipore公司；磷酸盐缓冲液(PBS)、构橼酸钠抗原修复液均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.2 实验方法和步骤
1.2.1 细胞培养 A549细胞用含10%胎牛血清(FBS)H-DMEM细胞培养基，在5%的CO2饱和湿度、37℃恒温培养箱中常规培养。A549细胞呈单层贴壁生长，每2～3天换1次液，3～4 d传代1次。A549细胞经过消化传代，取对数生长期细胞待用。
1.2.2 药物处理与分组 槲皮素用DMSO配成储液后于-20℃冰箱保存。实验时用H-DMEM培养基稀释，DMSO的终浓度小于0.1%。实验分3组，分别为TGF-β未干预组(A组)、溶剂对照组(B组)和实验组(C组)。A组为H-DMEM+DMSO培养液，不含TGF-β，DMSO为等浓度溶剂；B组为H-DMEM培养+10 ng/mLTGF-β+DMSO，即槲皮素浓度为0；C组为H-DMEM培养液+10 ng/mL TGF-β+不同梯度浓度的槲皮素，槲皮素的终浓度分别为5、12.5、25、50、100、200 μmol/L。
1.2.3 MTT法检测 取对数生长期的A549细胞悬液，以每孔3×103个细胞接种于96孔培养板，每孔加含10%FBS及TGF-β(10 ng/mL)H-DMEM培养液200 μL，于37℃、5% CO2培养箱培养8 h，在倒置显微镜下观察细胞贴壁后，按上述分组分别加入200 μL完全培养液(TGF-β未干预组)、含DMSO的培养液(溶剂对照组)以及含不同药物浓度的培养液(实验组) ......
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