维生素D对细胞自噬及相关因子P62/SQSTM1、VDR表达的影响(2)
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1 材料与方法
1.1 实验动物
18月龄雄性SD大鼠21只，购自山西医科大学动物中心，体重350～500 g，颗粒饲料购自山西医科大学动物中心。
1.2 主要试剂
VD购自美国SIGMA公司，P62抗体、VDR抗体、β-actin抗体购自Santa Cruz公司，HRP羊抗兔二抗购自博士德公司，BCA蛋白分析盒购自博士德公司，ECL试剂盒购自博士德公司，预染蛋白Marker购自博士德公司，电镜及其相关材料由山西医科大学中心实验室提供。
1.3 动物分组
21只大鼠经过两周的洗脱期，通过随机分组分为三组：对照组；低剂量组[VD，0.025 μg/(kg·d)]；高剂量组[VD，0.1 μg/(kg·d)]，每组7只。
1.4 模型制备
生理盐水稀释VD，制备两种相应浓度，4℃保存。对照组给予正常饮食，不限进食量，剩余两组每天按照相应VD剂量给予灌胃干预。
1.5 标本采集
大鼠预麻处死，冰上取肝脏迅速切去一块，切成1 mm3大小，2%戊二醛固定液中静置2 h，缓冲液冲洗3次后置于缓冲液中4℃保存，用于电镜制片。剩余肝脏组织，-80℃保存，用于Western blot检测。
1.6 电镜观察
上述预处理的小块肝脏组织用二钾砷酸钠缓冲液漂洗2 h，放入1%的锇酸固定，于4℃保存2 h，从固定液中取出，依次放入30%、50%、70%的乙醇醋酸铀饱和液中，每种浓度饱和液均为10 min，取出组织再次分别放入80%、90%、100%乙醇中，每种浓度饱和液均为10 min，再放入包埋液中2 h，取出包埋37℃过夜，转入60℃温箱48 h，做1～2 μm切片，使用美兰染色光镜定位，制作超薄切片，染色后电镜下观察拍照、记录。
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