miR—196a在下咽鳞状细胞癌血浆中的表达及其临床意义(2)
1.5 实时荧光定量PCR按照逆转录miScript II Reverse Transcription (RT)试剂盒说明书，将1 μg RNA加入逆转录反应体系转录为cDNA。反应条件为37℃ 1 h，95℃ 5 min。逆转录成功完成后，加入100 μL DEPC水备用。用5 μL cDNA为模板按照miScript SYBR Green PCR试剂盒说明书加入10 μL 2×QuantiTect SYBR Green PCR混合物、1 μL 10×miScript通用引物、1 μL特异性引物、3 μL DEPC水配制20 μL反应体系。采用实时荧光定量PCR技术检测特异性miRNA的表达水平，反应条件为：95℃预变性15 min，94 ℃变性15 s，60℃退火30 s，70℃延伸30 s，实验重复3次。实验结果用阈值循环数Ct(Cycle threshold)来表示，并采用U6小RNA为内参消除标本误差，实验引物均由Qiagen公司设计合成。特异性miRNA的相对表达水平用△Ct值表示，通过Mx3005P PCR System测出每个样品的Ct值 ......
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