高脂高糖饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝组织TLR4和MyD88 mRNA的表达(2)
1.4.2 合成相关引物 从有关资料获得所需引物，并在基因库(Genebank)中进行核对。引物序列见表1，由上海Invitrogen 公司合成。
1.4.3 逆转录反应 用上述细胞中提取的2 μL总RNA加入0.2 mL离心管中，于70℃温育10 min，短暂离心后置于冰上。依据如下顺序加入以下试剂以建立一个20 μL的反应体系：MgCl2(25 mM)4 μL ，反转录10×缓冲液2 μL，dNTP混合物(10 mM)2 μL，重组的RNasin核糖核酸酶抑制剂0.5 μL，AMV反转录酶0.6 μL，随机引物1 μL，无核酸酶的水7.9 μL，总RNA 2 μL。将反应体系于室温温育10 min，于42℃温育60 min，于95℃加热5 min，再于4℃放置5 min。即为cDNA，放入-30℃存放。
1.4.4 PCR反应 取上述逆转录反应体系于18 μL反应体系中进行PCR反应。反应体系组成如下：2×Taq PCR Master Mix 9 μL，TLR4、MyD88上游引物 2 μL，TLR4、MyD88下游引物 2 μL，β-actin上游引物 2 μL，β-actin下游引物 2 μL，去离子水1 μL。变性94℃ 30 sec ......
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1.4.3 逆转录反应 用上述细胞中提取的2 μL总RNA加入0.2 mL离心管中，于70℃温育10 min，短暂离心后置于冰上。依据如下顺序加入以下试剂以建立一个20 μL的反应体系：MgCl2(25 mM)4 μL ，反转录10×缓冲液2 μL，dNTP混合物(10 mM)2 μL，重组的RNasin核糖核酸酶抑制剂0.5 μL，AMV反转录酶0.6 μL，随机引物1 μL，无核酸酶的水7.9 μL，总RNA 2 μL。将反应体系于室温温育10 min，于42℃温育60 min，于95℃加热5 min，再于4℃放置5 min。即为cDNA，放入-30℃存放。
1.4.4 PCR反应 取上述逆转录反应体系于18 μL反应体系中进行PCR反应。反应体系组成如下：2×Taq PCR Master Mix 9 μL，TLR4、MyD88上游引物 2 μL，TLR4、MyD88下游引物 2 μL，β-actin上游引物 2 μL，β-actin下游引物 2 μL，去离子水1 μL。变性94℃ 30 sec ......
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