1.2 实验方法

    首先在GeneBank中查询并获得染色体9p21基因SNP rs10757278的cDNA序列，参考相关文献设计，由Invitrogen公司进行引物的设计及合成。rs10757278的上游引物：5-TATTACAAATAGCTTCTCCACC-3；下游引物：5-TATTGTCTGCC-TTACATGTGCTAT-3；延伸引物：5-CGACTGTAGGTGCGTAACTCTGCGTCAA-ATCTAAGCT-GAGTGTTG-3。采用双蒸水将DNA稀释到浓度10 ng/μL，将PCR引物稀释到最终浓度为10 μmol/L，再将延伸物稀释到最终浓度为10 μmol/L。然后依次加入引物、dNTP、缓冲液、氯化镁、Taq酶及稀释后的DNA。对扩增循环参数进行调控，将其设定为在95℃变性15 min，然后94℃变性30 s、55℃退火30 s、再72℃延伸1 min，以上扩增步骤反复循环40次，最后将产物于4℃進行保存。向扩增产物中加入纯化液3 μL，并设置纯化反应条件为：37℃ 30 min，96℃ 10 min，后产物于4℃进行保存。再向每个样本中加入引物6 μL进行反应混合物的延伸，将反应条件设置为96℃ 3 min ......