陆展辉，李艳玲，孙婧怡，杨芙蓉，丁 煌，邓常清*，刘晓丹*

    湖南中医药大学中西医结合学院，中西医结合心脑疾病防治湖南省重点实验室，湖南 长沙 410208

    脑缺血再灌注损伤后，脑组织紧密连接被破坏，血脑屏障(blood brain barrier, BBB)通透性增高，进而继发的脑水肿，是导致高致残率、高死亡率的主要原因之一，直接影响患者的疗效和预后[1]。脑微血管内皮细胞(brain microvascularendothelial cells, BMECs)是维持BBB 结构和功能完整的主要组成单位，其紧密连接蛋白是维持其屏障功能，限制大部分大分子蛋白和有害物质进入脑组织的结构基础[2-3]。 脑缺血再灌注损伤后内皮细胞的功能改变是最早的病理性损伤变化，因此，脑微血管内皮细胞的保护成为脑缺血治疗的重要靶点。

    黄芪甲苷(astragaloside Ⅳ, AST Ⅳ)和三七总皂苷(Panax notoginseng saponins, PNS)分别是中药黄芪和三七中具有心脑血管效应的重要有效物质，课题组前期对其脑缺血后的神经保护作用和机制做了大量研究，最新研究发现黄芪甲苷和三七总皂苷可减轻脑缺血再灌注后BBR 损伤，减轻脑缺血后脑微血管内皮细胞凋亡[4-8]。 基于此，本研究拟采用离体培养大鼠BMECs，建立体外脑缺血再灌注模型，研究中药有效组分配伍对rBMECs 屏障功能的保护作用，为中药有效组分抗脑缺血治疗提供依据。

    1 材料

    1.1 实验动物

    健康新生5～7 d SD 大鼠6 只，雌雄各半，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物质量合格证号ZS-202007210009，饲养于湖南中医药大学动物实验中心，实验动物许可证号SYXK(湘)2013-0005。 实验符合湖南中医药大学动物伦理委员会要求，伦理委员会编号LLBH-202004290001。

    1.2 主要药物与试剂

    AST Ⅳ(质量分数≥98%，批号：MUST-17022804)、PNS(质量分数≥98%，批号：MUST-17060601)购于成都曼思特生物科技有限公司；CCK-8 试剂盒(中国伊莱瑞特公司，批号：E-CK-A362)，重组Anti-Occludin 抗体、重组Anti-ZO1 tight junction 蛋白抗体、NF-κB-p65 抗体(美国Abcam 公司，货号：ab216327、ab221547、ab32518)；ICAM-1 抗体、VCAM-1 抗体、p-NF-κB-p65 抗体(Santa Cruz Biotechnology 公司 ......