张爱兴 ，马晓溪 ，陈冉 ，李庆 ，张慧 ，王玉明

    (1.昆明医科大学第二附属医院检验科，云南 昆明 650101；2.昆明医科大学第一附属医院检验科，云南 昆明 650032)

    肺癌是我国发病率及死亡率最高的癌症种类，有研究显示，该疾病的年死亡率为42.09/10万[1]。尤其是地处西南部的云南宣威地区。研究显示宣威肺癌患者中,男性和女性平均患病死亡率分别为 98.10/10 万，83.28/10 万[2]，居世界之首[3]。 p53 正向凋亡调控因子 (p53 up-regulated modulator of apoptosis，PUMA)是近年来发现的一种促凋亡因子,它是Bcl-2家族中BH3-only亚家族的成员,在p53依赖与非依赖性细胞凋亡途径中均起重要作用，PUMA基因上游启动子序列中含p53的结合位点,受凋亡信号刺激后,p53可直接与其靶位点结合而促进PUMA的转录及蛋白表达[4,5]。前期研究显示,从肺癌组织中筛选出对PUMA可能具有调控作用的miRNA，其中有10条miRNA表达上调，miR-221升高较为明显[6]。迄今为止，关于miR-221调控肺癌细胞生长的系统性研究在国内外鲜见报道，由此，本研究根据miRNA的作用机制构建双荧光报告载体，以验证PUMA是否为miR-221的靶基因，进一步通过后续实验研究miR-221在宣威肺癌的发生、发展过程中可能具有的作用机制。

    1 材料与方法

    1.1 细胞株及主要试剂 宣威肺癌细胞株(XWLC-05)购自中国科学院云南省肿瘤研究所；质粒pm irGLO购自美国Promega公司；质粒抽提试剂盒购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司；TRIzol、Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；Dual-Luciferase?Reporter Assay System、Caspase-Glo?3/7 Assay、Caspase-Glo?9 Assay购自美国 Promega公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司；miR-221过表达/抑制表达载体购自美国GeneCopoeia公司；Taq DNA聚合酶 、Primescript RT Reagent kit、SYBR Premix Ex Taq kit购自日本TaKaRa公司 ......